Kv1.3钾通道新型抑制剂甲氨蝶呤的发现、作用机制和分子设计研究

The Kv1.3 channel is a therapeutic target for autoimmune diseases, and peptide inhibitor ShK-186 from America is the only lead drug that has entered clinical experiments (Phage II). To the best of our knowledge, peptide lead drugs always interact with the Kv1.3 channel outer pore region, but small molecular lead drugs always interact with the Kv1.3 channel inner pore region. So, small molecular lead drugs have low selectivity and high toxicity. In preliminary experiments for this project, we found that an old drug methotrexate is a new selective inhibitor of the Kv1.3 channel. Interestingly, methotrexate, a small molecule, might interact with the Kv1.3 channel outer pore region, just like peptide lead drugs. Based on these studies, this project will carry out following works: (1) Discovery and confirm the interaction between methotrexate and the Kv1.3 channel, (2) Mapping methotrexate on the Kv1.3 channel outer pore region, (3) Structure-activity relationship of methotrexate interacting with the Kv1.3 channel, (4) New lead drug design based on interaction mechanisms and structure-activity relationship between methotrexate and the Kv1.3 channel. These studies will provide a new idea to discovery small molecular lead drugs for autoimmune diseases, and open a new field for deep understanding and effective development of methotrexate.

Kv1.3钾通道是自身免疫疾病的新靶点，美国研发的多肽ShK-186是唯一进入临床试验的先导药物（临床II期）。研究发现：多肽类先导药物作用Kv1.3钾通道外孔的非保守区，有机小分子作用内孔的保守区，因此，有机小分子往往选择性低，毒副作用大。预实验中，我们首次发现临床小分子药物甲氨蝶呤是Kv1.3选择性抑制剂，机制探索提示其采用独特的“多肽样模式”识别Kv1.3外孔的非保守区。据此，本项目拟系统地开展：（1）Kv1.3钾通道新型抑制剂甲氨蝶呤的发现和功能确认，（2）甲氨蝶呤识别Kv1.3外孔区的分子机制，（3）甲氨蝶呤抑制Kv1.3的构效关系和机制，（4）基于甲氨蝶呤识别新靶点Kv1.3钾通道外孔区和已知酶分子靶点活性中心区的机制和构效关系差异，分子设计新型Kv1.3钾通道选择性抑制剂，为靶向Kv1.3钾通道有机小分子类先导药物研发提供新思路，为深入认识和应用甲氨蝶呤分子奠定科学基础。

Kv1.3钾通道是自身免疫疾病的新靶点，美国研发的多肽ShK-186是唯一进入临床试验的先导药物（临床II期）。研究发现：多肽类先导药物作用Kv1.3钾通道外孔的非保守区，有机小分子作用内孔的保守区，因此，有机小分子往往选择性低，毒副作用大。本项目，我们首次发现临床小分子药物甲氨蝶呤是Kv1.3选择性抑制剂，甲氨蝶呤对Kv1.1，Kv1.2和Kv1.3抑制作用的IC50分别为4500 nM,12500 nM 和42 nM，对Kv1.1通道的选择性为107倍，对Kv1.2通道的选择性为298倍，Kv1.3钾通道亚型的选择性优于目前认为最有前途的有机小分子先导化合物PAP-1。机制探索提示其采用独特的“多肽样模式”识别Kv1.3外孔的非保守区。通过构建Kv1.2钾通道（S1-S2 linker区域被来自Kv1.3钾通道替换），Kv1.2钾通道（S3-S4linker区域被来自Kv1.3钾通道替换）和Kv1.2钾通道（S5-S6 linker区域被来自Kv1.3钾通道替换），我们比较了甲氨蝶呤对这三种嵌合体钾通道、Kv1.2钾通道和Kv1.3钾通道的抑制作用，发现只有Kv1.2钾通道（S5-S6 linker区域被来自Kv1.3钾通道替换）的嵌合体获得了甲氨蝶呤敏感性，而其它区域的替换影响较小；据此判定：甲氨蝶呤作用Kv1.3钾通道的S5-S6 linker区域。进一步的定点突变实发现：改变Kv1.3钾通道外孔区域的单个氨基酸，对甲氨蝶呤的活性具有明显的影响，提示其作用的具体区域为钾离子通道的外孔区。甲氨蝶呤作用于钾通道的方式，与经典的动物毒素多肽及其类似物（比如，临床II期药物Shk-186）的作用区域是一致的，而与经典的有机小分子药物作用内孔区的机制完全不同，说明甲氨蝶呤是一个新型的分子骨架。我们的研究为靶向Kv1.3钾通道有机小分子类先导药物研发提供新思路，为深入认识和应用甲氨蝶呤分子奠定科学基础，后续我们将在甲氨蝶呤的细胞水平功能深入研究甲氨蝶呤的免疫抑制功能，以及该抑制功能的Kv1.3钾通道依耐性机制；在此基础上，对于甲氨蝶呤的构效关系和分子改造方面需求多科学课交叉研究和团队合作，服务于靶向Kv1.3钾通道的、治疗自身免疫疾病的、有机小分子类新型的先导药物研发。