转录起始过程通用转录因子TFIIH结构生物学研究

Pre-initiation complex (PIC) has fundamental roles in transcriptional regulation in all eukaryotes. PIC comprises of RNA polymerase II, general transcription factors, Mediator complex and gene-specific transcription factors. The general transcription factors, including TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIF, TFIIH and TFIIS, are conserved among all eukaryote organisms. TFIIH possess helicase and ATPase activity that can promote the formation of transcription bubbles. TFIIH consists of 11 subunits, which have been divided into two modules, the core sub-complex and TFIIK module. Among these subunits, Tfb1, Tfb2, Tfb4, Tfb5, Rad3 and Ssl1 assemble as a stable core complex, which recruits Ssl2 and TFIIK to form an intact TFIIH complex. TFIIH is the only one general transcription factor that has no high-resolution structure yet. Our this proposal aims at the structural determination of TFIIH and its interaction with other protein complexes such as RNA polymerase II and Mediator complex and elucidating the mechanism of the transcriptional regulation in all eukaryotes.

基因转录是生命体最基础的生命活动。基因转录是指遗传信息（DNA）经过多蛋白复合物的参与指导RNA合成的过程。这个过程涉及多个蛋白复合物包括RNA聚合酶II、通用转录因子、基因特异的转录因子、中介体复合物等。其中通用转录因子TFIIH具有解旋酶和ATPase活性，可以催化转录起始过程“转录起始泡”的形成。对于转录起始过程至关重要。真核生物TFIIH包含核心复合物模块、TFIIK模块，共11个亚基。TFIIH核心复合物由Tfb1、Tfb2、Tfb4、Tfb5、Rad3、Ssl1等亚基组成，TFIIK及Ssl2会组装到这个核心复合物上形成完整的TFIIH。本研究拟对TFIIH开展高分辨率结构生物学研究，希望通过解析其高分辨率结构以及其与中介体复合物和RNA聚合酶II的相互作用模式，深化转录起始过程的认识。

基因转录是原核和真核生物最基础的生命活动。基因转录是指遗传信息（DNA）经过各种加工过程生成信使RNA的过程。这个过程涉及多种蛋白复合物包括RNA聚合酶II、各种通用转录因子、基因特异型转录因子、中介体复合物等。其中通用转录因子TFIIH具有解旋酶和ATPase活性，可以催化转录起始过程“转录起始泡”的形成从而打开DNA双链。对于转录起始过程和DNA修复尤其是核苷酸切除修复至关重要。TFIIH包含核心复合物模块、TFIIK模块，共10个亚基。TFIIH核心复合物由Tfb1、Tfb2、Tfb4、Tfb5、Rad3、Ssl1、Ssl2等亚基组成，TFIIK中的CDK8、CycH、Ccl1会组装到这个核心复合物上形成完整的TFIIH。此外，TFIIH还与XPC-Rad23-CEN2形成核苷酸切除修复过程复合物，参与识别紫外线引起的CPD类型DNA损伤及修复过程。.本研究利用昆虫细胞MultiBac系统构建了融合质粒，在昆虫细胞中高效表达并成功纯化了Tfb1-Tfb2-Tfb4-Tfb5-Ssl1-Ssl2复合物，分子量达到300 kDa。该复合物比例和纯度都非常合适用于结构生物学研究。我们首先用该样品进行了负染电镜的观察，初步结果表明样品非常均一。但是正当我们在进行冷冻电镜样品优化时，2017年底，美国加州大学伯克利分校Eva Nogales实验室在Nature上发表了TFIIH 4.4埃电镜结构。我们注意到TFIIH还会与识别DNA损伤的复合物XPC-Rad23-CEN2一起参与核苷酸切除修复，因此，我们转换了思路，拟继续攻克XPC-Rad23-CEN2-TFIIH-DNA这一更大复合物。我们经过艰苦摸索，成功组装出了损伤DNA-TFIIH-XPC-Rad23复合物，SDS-PAGE及负染电镜均显示它性质比较适合用于冷冻电镜研究。目前，冷冻电镜样品遇到了电镜制样过程中最常见的蛋白样品解聚问题，目前还在进一步优化中。