组织纤维化进程中BNIP3L对成纤维细胞的调控作用及其分子机制

Tissue remodeling induced by fibrosis has been viewed as a major medical problem that leads to progressive dysfunction of the organ and eventually the death of patients，however, the effective preventative measures and therapies of fibrosis remains unclear. Our preliminary studies have found that BNIP3L promotes extracellular matrix protein (ECM) expression in NIH/3T3 fibroblasts. This proposal is to systemically examine the relationship between fibroblasts activation, ECM accumulation and BNIP3L expression during cardiac fibrosis, liver fibrosis, lung fibrosis and kidney fibrosis, which may proclaim one new pro-fibrogenic factor. Determine the effect of BNIP3L on the activation of TGF-β and ECM accumulation, to reveal the important biological function of BNIP3L in fibroblasts. Define the functional domain of BNIP3L-induced fibrosis, explore the role of IP3R-Ca2+-TGF-β signal pathway during the endoplasmic reticulum-localized BNIP3L induced fibroblasts fibrosis, and discuss the role of ROS-p38MAPK-TGF-β signal pathway during the mitochondrial localized BNIP3L induced fibroblasts fibrosis, to clarify the molecular mechanism of endoplasmic reticulum-localized BNIP3L and mitochondrial- localized BNIP3L in fibroblasts. The successful completion of this project will validate BNIP3L as an important pro-fibrogenic factor during tissue fibrosis and provide potential target for prevention and/or treatment of tissue fibrosis.

纤维化导致的组织重构是多种疾病导致器官功能紊乱、甚至死亡的主要原因，但目前尚无有效治疗手段。本项目组率先发现BNIP3L在心脏成纤维细胞中具有重要作用，据此我们拟通过系统研究，发现心、肝、肺、肾纤维化过程中BNIP3L表达及细胞分布与成纤维细胞细胞外基质蛋白沉积的生物学规律，揭示一种新的纤维化调控分子；探索成纤维细胞BNIP3L对TGF-β信号活化的影响及其纤维化效应，揭示BNIP3L对组织纤维化机制的调控作用；明确 BNIP3L诱导纤维化的重要功能结构域，探索IP3R-Ca2+-TGF-β/Smad信号通路在内质网定位的BNIP3L诱导纤维化中的重要作用，ROS-p38MAPK/TGF-β信号通路在线粒体定位的BNIP3L诱导纤维化中的重要作用，揭示内质网、线粒体定位的BNIP3L诱导纤维化机制的关键分子途径；为阐明组织纤维化的生物学基础提供新的科学依据，为控制组织纤维化提供新的思路。

在全世界范围内，组织纤维化导致的重构是多种疾病导致器官功能紊乱、甚至致残、致死的主要原因，但尚无特效诊疗手段。BNIP3L 在各重要脏器中均有适度的表达，而目前关于 BNIP3L 与各组织纤维化的关系在国内外尚未见报道。我们成功建立了心脏、肝脏、肾脏、肺脏组织纤维化动物模型，发现了成纤维细胞内BNIP3L的表达水平与重要脏器纤维化存在明显的正相关关系，采用NE诱导NIH/3T3细胞建立了离体细胞纤维化模型，发现成纤维细胞内BNIP3L表达与NE诱导的细胞外基质蛋白表达密切相关，提示BNIP3L可能是组织纤维化发生的重要调控分子。成功构建了BNIP3L高表达及siRNA载体，通过上述载体调控成纤维细胞内BNIP3L表达，发现了其对成纤维细胞纤维化具有重要的调控作用。随后，成功构建了缺失C末端的BNIP3L高表达突变体，发现其可高效转染成纤维细胞并调高BNIP3L的表达，但却丧失了促纤维化的作用，表明BNIP3L发挥其促纤维化作用依赖于其C末端跨膜区域。此外，成功构建了BNIP3L-cb5以及BNIP3L-Acta高表达突变体，发现其可特异性定位于成纤维细胞的线粒体或内质网，采用BNIP3L-cb5或 BNIP3L-Acta调控成纤维细胞线粒体或内质网内的BNIP3L表达水平，发现特异性定位于线粒体及内质网的BNIP3L均具有调控纤维化的生物学作用。随后研究发现特异性定位于内质网的BNIP3L可以显著诱导成纤维细胞细胞内钙离子浓度的增加，诱导TGF-β/smad 信号通路的活化，调高成纤维细胞内质网内的BNIP3L水平，BNIP3L通过与BCL-XL结合抑制BCL-XL与IP3R的相互作用导致IP3R通道开放是其调控成纤维细胞内钙离子的重要分子机制，揭示了特异性定位于内质网的BNIP3L主要通过IP3R -Ca2+-TGF-β/Smad信号通路诱导纤维化的发生。而特异性定位于线粒体的BNIP3L可以显著激活P38MAPK，抑制P38MAPK活化可以显著改善BNIP3L的对TGF-β信号通路的活化，同时研究发现抑制ROS的聚集，BNIP3L导致的P38MAPK活化显著得到缓解，表明特异性定位于线粒体的BNIP3L通过ROS-P38MAPK/TGF-β信号通路促进纤维化的发生。本项目揭示了BNIP3L在组织纤维化中的生物学作用及其分子机制，为防治组织织纤维提供新的靶点。