盐藻类胡萝卜素合成调控相关的转录因子基因的作用分析

Carotenoids are an important bioactive substances in Dunaliella parva. However, the lower content of carotenoid greatly limited the development of health value in Dunaliella parva. The applicant had cloned three genes related to carotenoid biosynthesis and their promoters, studied the responses of these genes to salinity up-shock and nitrogen limitation, and found several cis-acting elements in these promoters in Dunaliella parva. The regulatory mechanism of transcription factors binding with these elements in carotenoid biosynthesis is still unclear. Based on the previous studies, yeast one-hybrid system will be used to clone genes encoding transcription factors binding with these environmental response cis-acting elements which are utilized as baits. Firstly, this project will study the binding of transcription factors to promoters. Secondly, this project will study DNA and protein binding with transcription factors through chromatin immunoprecipitation and yeast two-hybrid system technology, respectively. At last, this project will further study the effect of these transcription factor genes on key enzyme genes in carotenoid biosynthesis pathway and demonstrate their function through overexpression in Dunaliella parva. The results will contribute to further understanding of the molecular mechanism of carotenoid biosynthesis in Dunaliella parva. Meanwhile, the results will provide a new idea and target for molecular breeding of microalgae and lay the foundation for a great enhancement of carotenoid content through manipulating the expression of transcription factor genes in microalgae.

类胡萝卜素是盐藻的重要生物活性物质，但其含量较低，极大地限制了盐藻保健价值的开发。我们克隆了盐藻类胡萝卜素合成途径的3个基因及其启动子，研究了这些基因对盐振荡和限氮胁迫的响应，同时发现一些顺式作用元件在这些启动子中广泛存在，但与这些元件相结合的转录因子对盐藻类胡萝卜素生物合成的调控机理尚未明确。本项目在前期研究的基础上，以环境响应相关的顺式作用元件作为诱饵，利用酵母单杂交方法克隆与之结合的转录因子基因，研究转录因子与启动子的体外结合特性。同时通过染色质免疫共沉淀和酵母双杂交技术分别研究与转录因子结合的DNA和蛋白质。最后通过超量表达研究转录因子基因对类胡萝卜素生物合成途径中关键酶基因的调控作用，阐明其在类胡萝卜素生物合成中的作用。本研究将有助于加深对盐藻类胡萝卜素生物合成分子机制的认识，为微藻的分子育种提供新的思路和靶标，为将来通过操纵转录因子基因的表达实现微藻大量积累类胡萝卜素奠定基础。

类胡萝卜素是盐藻的重要生物活性物质，但其含量较低，限制了盐藻保健价值的开发。前期克隆了盐藻类胡萝卜素合成途径的3个基因及其启动子，但与这些启动子结合的转录因子对盐藻类胡萝卜素合成的调控机理尚未明确。本研究克隆了调控类胡萝卜素合成的转录因子基因DpAP2（ON548537）。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）研究了与DpAP2结合的DNA，ChIP-Seq共鉴定出902个靶基因，重点阐述了参与碳水化合物代谢（包括淀粉和蔗糖代谢、光合作用、糖酵解/糖异生、三羧酸循环）的靶基因及类胡萝卜素合成相关的靶基因（Z-ISO、CRTISO、AOG）。通过酵母双杂交共鉴定出3个DpAP2的互作蛋白（ON548534-DNA结合转录因子活性、ON548535-蛋白激酶活性、ON548536-α-D-磷酸己糖异构酶）。转基因盐藻（超表达DpAP2）类胡萝卜素含量3.17mg/g DW比对照高出46.76%，表明DpAP2对类胡萝卜素合成有促进作用。PEG-4000和CaCl2胁迫下，盐藻类胡萝卜素含量增加。与对照1.96mg/g DW相比，80ppm PEG/40ppm CaCl2处理后，最高含量为2.78/3.11mg/g DW。在40/20ppm CaCl2和80/120ppm PEG作用下，盐藻类胡萝卜素的还原能力显著上升。20ppm CaCl2（2.07）和40ppm CaCl2（1.72）的还原力活性显著高于对照（1.17）；PEG（80ppm、120ppm）的还原力活性（1.33、1.59）同样显著增强。40ppm CaCl2胁迫下，SOD活性最高为70.33%，高于对照（53.09%）；80ppm PEG处理下SOD活性（65.94%）高于对照（54.44%）。通过ChIP-Seq鉴定了盐藻油脂合成相关的转录因子WRINKLED1-like的靶基因，涉及糖类代谢、脂质代谢、光合作用和转录因子。通过Genome Walking克隆了DpAP2的启动子1881bp，预测了其中的元件。通过响应面法优化了盐藻类胡萝卜素的提取条件。时间20min、温度40℃和DMSO: 95%乙醇=3.64:1时，提取率提高了18.19%；温度57.2℃、时间11.35min、 DMSO体积410μL时，提取率提高了31.69%。本研究为微藻的分子育种提供了新的思路和靶标。