TGF-β、Smad4失活与KrasG12D活化在结肠癌肝转移中的协同作用

结肠癌是世界最常见的肿瘤之一，肝转移是其主要死亡原因。TGF-β/Smad、Kras通路与结肠癌肝转移密切相关，但其相互作用及机制尚不明了。申请者发现：高转移潜能的鼠结肠癌细胞系CT26具备KrasG12D活化，靶向抑制TGF-β可降低CT26的肝转移；Smad4在TGF-β诱导的结肠癌肝转移中起保护作用。本课题将以CT26细胞为实验对象，研究TGF-β、Smad4失活与KrasG12D活化协同促进结肠癌肝转移的机制。一：观察敲减KrasG12D表达对TGF-β诱导的结肠癌肝转移的影响。二：稳定表达TβRI突变体RImL45，观察在TGF-β信号减弱的状态下，KrasG12D活化是否足以促进结肠癌肝转移。三：敲减Smad4表达，观察Smad4失活和KrasG12D活化对肝转移的协同效应。本课题将加深对结肠癌肝转移机制的了解，为其多靶点联合治疗提供新思路。

目的：建立CT26-Smad4KD稳定细胞系并对其进行鉴定。并探讨Smad4蛋白在小鼠结肠癌细胞增殖及转移表型中的作用。.方法：在野生型CT26细胞系中，采用慢病毒感染的方式建立Smad4干扰组以及相应的空载体对照组。以western blot和Co-immunoprecipitation检测上述细胞克隆中Smad4蛋白的表达情况及Smad2/3/4复合物的形成情况。并对非Smad通路中MAPK通路进行初步检测。通过CCK-8实验，观察及比较野生型CT26细胞、阴性对照组及Smad4KD细胞的生存曲线。利用划痕实验、transwell细胞迁移及侵袭实验，评估野生型CT26细胞、阴性对照组及Smad4KD细胞的迁移及侵袭能力。结合TGF-β与MAPK/JNK抑制剂SP600125，以及MAPK/ERK抑制剂PD98059和U0126，使用transwell细胞迁移实验研究Smad4KD细胞在阻断JNK或ERK通路后，其纵向迁移能力的变化，并在Balb/c小鼠肝转移模型中探讨敲减Smad4后和使用U0126的肝转移能力。.结果：成功建立CT26-Smad4KD细胞系及其阴性对照。划痕实验表明，敲减Smad4增强CT26细胞的爬行能力。Transwell细胞迁移和侵袭实验表明，敲减Smad4后，其迁移和侵袭能力明显增强。使用MAPK/JNK或MAPK/MEK抑制剂能减弱Smad4KD细胞增强的迁移能力。另外体内实验表明，U0126显著抑制TGF-β诱导的Smad4KD细胞的肝转移。这种抑制作用可能是U0126促进MMP2，抑制COX-2表达引起的。.结论：成功建立CT26-Smad4KD细胞系及其阴性对照。干扰Smad4促进CT26细胞的运动性及侵袭能力。Smad4下调引起的侵袭表型可以被JNK和ERK通路抑制剂减弱。U0126能通过促进MMP2，抑制COX-2，从而抑制Smad4KD细胞的高转移表型。