HBHP基因修饰的iPS-MSCs联合一贯煎在慢性肝衰竭中的关键性炎症损伤的干预研究

Anti-inflammatory therapy is easily ignored in the prevention and treatment of chronic liver failure. It has been confirmed that the inflammatory mediator HMGB1, which could aggravate liver injury, has been induced in acute, acute and chronic hepatic failure and cirrhosis. However, it is still not clear whether HMGB1 has an impact on liver injury in chronic liver failure. In addition, although stem cell transplantation is expected to replace orthotopic liver transplantation in liver failure treatment, the development of therapy is limited for the difficult targeting therapy and insufficient homing of stem cell. Therefore, we hypothesized that “The iPS-MSCs, which were induced to gain the function of HMGB1 inhibition, combined with Yi Guan Jian which could promote stem cell homing provide prevention and treatment in chronic liver failure”. In this study, HBHP contained iPS-MSCs , which derived from chronic liver failure patients’ BMSCs through reprogramming, combined with Yi Guan Jian were treated in rat chronic liver failure. Immunohistochemistry, Western blot, magnetic resonance imaging technology , and so on were used to detect the therapeutic effect. The function of HMGB1 in chronic hepatic failure was explored and the potential advantages of iPS-MSCs combined with Yi Guan Jian in treating chronic liver failure were evaluated. The above content provides theoretical basis and application foundation for the clinical therapy of chronic liver failure.

在慢性肝衰竭的防治中，抗炎症治疗容易被忽视。经研究证实，在急性、急加慢性肝衰竭及肝硬化中，炎症介质HMGB1均被诱导并加剧了肝脏损伤。然而，在慢性肝衰竭中HMGB1对肝脏损伤是否有影响尚不清楚。此外，干细胞移植虽有望取代原位肝移植治疗肝衰竭，但靶向治疗难度大和归巢数量不足等原因限制了其发展。因此，我们提出“诱导抑制HMGB1功能的iPS-MSCs联合能够促进干细胞归巢的一贯煎对慢性肝衰竭的防治作用”的假设。本研究拟通过建立大鼠慢性肝衰竭模型，用慢性肝衰大鼠来源的BMSCs，重编程并诱导成为含HBHP序列的iPS-MSCs，再联合一贯煎对慢性肝衰大鼠进行干预。采用免疫组化、免疫蛋白印迹、核磁共振成像等技术验证治疗效果，探明HMGB1在慢性肝衰竭中的作用，并评价iPS-MSCs联合一贯煎治疗慢性肝衰竭的潜在优势，为临床慢性肝衰的治疗提供理论基础和应用依据。

背景：在慢性肝衰竭的治疗中，抗炎症治疗容易被忽视。经研究证实，在急性、急加慢性肝衰竭及肝硬化中，炎症介质HMGB1均被诱导并加剧了肝脏损伤。然而，在慢性肝衰竭中HMGB1对肝脏损伤的影响尚不清楚。此外，HMGB1-A box被发现能有效抑制HMGB1本身的促炎作用。因此，我们提出“HBHP通过结合HMGB1-A box抑制HMGB1在慢性肝衰竭的防治作用”。研究内容：本研究通过建立慢性肝衰竭大鼠模型，腹腔注射HBHP后观察大鼠肝脏的病理学改变；免疫组化和蛋白免疫印迹实验检测大鼠肝脏组织中HMGB1的表达水平，以及NF-κB炎症通路的表达水平；其次利用CRISPR/Cas9 技术建立HMGB1基因敲除细胞模型，采用流式细胞法、MTT以及蛋白免疫印迹等技术检测相关炎症通路的表达情况；同时检测在LPS诱导的细胞模型中，HBHP处理前后HMGB1以及相关炎症因子的表达水平；最后拟进一步验证HBHP通过结合HMGB1-A box来抑制炎症反应。重要结果：1)在CCL4诱导的慢性肝衰竭大鼠模型中，腹腔注射HBHP能够改善肝脏的炎症反应，同时有效抑制HMGB1的表达水平；促进Nrf2、HO-1和NQO1等抗氧化应激因子的表达，以及抑制NF-κB信号通路的表达；2)在HMGB1基因敲除模型中，LPS诱导的细胞凋亡和相关炎症反应被有效抑制；3)在LPS诱导的RAW264.7细胞中，HBHP能够通过结合HMGB1-A box来减少细胞凋亡反应，同时有效抑制氧化应激反应和炎症信号通路。关键数据：1)验证了在慢性肝衰竭大鼠模型以及相关细胞模型中，HMGB1的表达均显著增高，表明了HMGB1在炎症性损伤中的关键性作用；2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立HMGB1基因敲除模型，同时验证了敲除后相关炎症反应也被有效抑制，表明HMGB1在炎症级联反应中的主导地位；3)验证了在慢性肝衰竭大鼠模型和相关细胞模型中，HBHP能够显著的抑制HMGB1以及相关炎症信号通路的表达，同时正在进一步证实HBHP是通过结合HMGB1-A box来抑制HMGB1诱导的一系列炎症反应。科学意义：1)证实了HMGB1能够成为慢性肝衰竭防治的新靶点；2)阐明了HBHP通过抑制HMGB1治疗慢性肝衰竭的分子机制。