杨树引入C4光合固碳途径关键酶的分子基础研究

CA、PEPC、PPDK、NADP-ME、PEPCK是C4植物光合固碳途径的关键酶,在C3和C4植物中都普遍存在，但在C3植物中其酶活性特别低。本研究利用分子生物学、生物信息学、细胞生物学和生物化学技术研究杨树、玉米的CA、PEPC、PPDK、NADP-ME、PEPCK在不同浓度的CO2、光照条件下的转录、翻译、翻译后修饰差异，揭示杨树、玉米上述酶在固碳生理功能上的差异；鉴定这些关键酶活性的调控蛋白质（激酶、酯酶或辅酶等），探明这些调控蛋白质调节杨树和玉米上述关键酶固碳分子机制，初步构建C4光合固碳途径关键酶调控网络和彼此协同作用模式, 为实现杨树引入C4光合固碳途径、培育高效固碳的优质碳汇林木新品种奠定基础。

本项目首先研究了C4途径关键酶PPDK的酶活性调控机制。研究表明玉米C4PPDK的酶活性受光强调控。光强通过调控其蛋白序列上第527号苏氨酸（T527）的可逆磷酸化进而调控该酶的活性。即随着光强的提高，去磷酸化的PPDK分子数增多活性增强；而随着光强的降低，磷酸化的形式的PPDK增多，酶活性降低。这一调控模式很好的解释了PPDK在C4光合途径中的调控机制，是C4光合作用理论的重要补充。PPDK的酶活性是受其调控蛋白PDRP调控的。PDRP同时具有磷酸激酶（磷酸化）和磷酸酶（去磷酸化）功能。我们的研究表明，PDRP的酶功能可能是由于光强改变了细胞内代谢物的组成而受调控的，即随着光强的增高，其磷酸激酶活性增高磷酸化PPDK，而随着光强降低其磷酸酶活性升高对PPDK进行去磷酸化。为了深入研究PDRP的调控作用，我们解析了PDRP的晶体结构。确定了催化PPDK磷酸化和去磷酸化的响应结构域。其次，利用质谱技术我们在玉米另外一条C4途径（PEPCK途径）的关键酶PEPCK中鉴定到了4个磷酸化位点。利用特异性磷酸化抗体进行Western blot检测和酶活性分析实验表明其中至少两个位点的可逆磷酸化与酶的活性相关，而且明显受光调控。这些结果表明光照通过调控关键位点上的可逆磷酸化来调控C4光合固碳途径关键酶的酶活性。. 我们系统分析了C3植物杨树中C4途径关键酶的高度同源蛋白在各个组织中的表达模式、表观遗传学调控机制和酶活性。利用转基因技术在杨树体内过表达PEPCK和PPDK基因；利用RNA干扰技术干扰PPDK和PEPCK基因在杨树内的表达，同时利用代谢组学方法对其功能进行验证。同时也比较分析了玉米C4途径关键酶PPDK和PEPCK在不同组织中的表达模式和表观调控机制，进一步阐明了C4途径关键酶的进化意义。