自组装环境敏感型纳米球晶介导STAT3靶标肽的胞内转运及重建肿瘤免疫微环境的基础研究

How to reverse the immune suppressive effect of tumor microenvironment has become a key scientific problem to be solved in the course of clinical efficacy of tumor vaccine. Because of the high specificity and low toxicity, the peptide inhibitors have an irreplaceable role in blocking the STAT3 signal transduction pathway, and then repair the immune suppressive tumor microenvironment. However, the low stability, high plasma clearance and poor cell membrane permeability in vivo restrict their clinical application. Therefore in this project, we proposed to construct the spherical crystallized polysaccharide self-assembly with controllable size under the nano confined environment. Compared to conventional nano-gel carriers, the vehicles possess advantages of non-chemical crosslinking, high loading capacity for peptide, plasma stability and environmental sensitivity. The multifunctional nano-spherulites can mediate the loaded STAT3 target peptides to intracellular transport, and then to reverse the immune suppression effect in tumor microenvironment by targeted blocking the signal transduction pathway. Therefore the improved Immune therapeutic effects of DCs tumor vaccine are expected. The construction mode of the delivery system and the related research have not been reported in the world. Studying the action mechanism of their intracellular transport and synergistic treatment with tumor vaccine, has great theoretical and practical significance to improve the druggability of target peptide and effectively reverse the immune suppressive effect during tumor vaccine therapy.

如何逆转肿瘤微环境的免疫抑制效应已成为提高目前肿瘤疫苗临床疗效过程中亟待解决的关键科学问题。多肽类STAT3抑制剂因其特异性强、毒副作用低而在阻断相应信号转导通路，继而修复免疫抑制性肿瘤微环境中具有不可替代的作用。然而稳定性差、血浆清除率高、细胞膜渗透性低的体内行为使多肽在临床应用中受到很大限制。为此，本项目拟在纳米受限环境下构筑尺寸可控性的糖基纳米球晶化自组装物，相较于传统纳米载体具有非化学交联、肽负载量大、血浆稳定性高以及环境敏感性等优势。负载STAT3靶标肽的多功能纳米球晶可介导其胞内转运，通过靶向阻断免疫调节相关信号转导通路逆转肿瘤微环境中的免疫抑制效应，从而改善DCs肿瘤疫苗的免疫治疗效果。该递送系统的构建模式及相关研究国内外未见报道，对其胞内转运及与肿瘤疫苗协同治疗的作用机制进行研究，对于提高活性肽的成药性以及有效逆转肿瘤疫苗治疗过程中的免疫抑制效应，具有重大的理论和实践意义。

如何逆转肿瘤微环境的免疫抑制效应已成为提高目前肿瘤疫苗临床疗效过程中亟待解决的关键科学问题。多肽类STAT3抑制剂因其特异性强、毒副作用低而在阻断相应信号转导通路，继而修复免疫抑制性肿瘤微环境中具有不可替代的作用。然而稳定性差、血浆清除率高、细胞膜渗透性低的体内行为使多肽在临床应用中受到很大限制。为此，本项目在已取得良好工作的基础上，对纳米受限环境下构筑尺寸可控性的糖基纳米球晶化自组装物进行深入系统的探索研究，相较于传统纳米载体具有非化学交联、肽负载量大、血浆稳定性高以及环境敏感性等优势，并取得一批有特色、有影响的成果：完成了环境敏感型多糖（IM-DEX）的合成与表征工作，纳米球晶收率>82%，粒径130～150nm，粒度分布均匀且分散性良好；载入靶标肽后能很好的保持原有生物活性；具有良好的肿瘤微环境响应性，在酸性条件下（pH=5.5）的累积释放百分比约为85％，而生理条件下（pH=7.4）的泄漏率不超过20％。该纳米球晶给药系统能被肿瘤细胞高效摄取，其摄取效率为游离药物的3.7倍，且具有溶酶体逃逸效应；与游离药物相比可以更有效地抑制细胞增殖，IC50值存在显著性差异。体外机制研究表明，该纳米球晶给药系统通过抑制肿瘤细胞内STAT3水平从而诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。小鼠活体成像结果显示，借助纳米球晶材料缓慢降解的特点，逐渐释放药物，在较长时间内持续维持小鼠瘤内靶标肽的有效浓度，实验结果显示Tyr@IM-DEX/L组在肿瘤组织的平均荧光光强度是游离pTyr组的6.2倍，证明球晶载体可以増加pTyr在肿瘤组织的蓄积，从而有效抑制STAT3的表达。肿瘤组织冷冻切片和体内药效学实验结果表明pTyr纳米球晶制剂的抑瘤率可以达到67.8%，可以有效抑制肿瘤部位的增殖。特异性阻断STAT3信号通路进一步提高了肿瘤微环境中CD4+和CD8+ T淋巴细胞的组成比例，同时降低了调节性T细胞的组成，并促进树突状细胞的成熟和活化。对给药后小鼠组织进行HE染色观察发现，各组织器官与生理盐水组比较无显著差异，无明显病理变化，证明纳米球晶具有良好的初步安全性，从而达到了本课题的预期研究目的。