激活沉默基因诱导黑蛋鸟巢菌次生代谢产物化学多样性和生物活性多样性的研究

Higher fungi have always been an important resource for novel bioactive compounds, providing drugs or lead compounds of considerable therapeutic potential, either the fruiting bodies or the fermentation broth. Because of short growing period, low output and perishables of the fruiting bodies, collecting plenty fruiting bodies can be difficult and costly. Hence, fermentation has become a popular way to obtain secondary metabolites. However, the capability of higher fungi to produce secondary metabolites has been substantially underestimated because many of the biosynthesis gene clusters remain silent or less active under standard cultivation conditions. Accordingly, activating the silent genes will be a new strategy that enables higher fungi to produce more unforeseeable secondary metabolites. In our previous study, several cyathane-type diterpenoids with neurotropic activity were isolated from the cultures of Cyathus, and small changes in the fermentation or co-culture with phytopathogen lead to big effect in the secondary metabolites. Moreover, the metabolites of the co-culture showed significant anti-phytopathogen activity. This project intends to active silent gene of Cyathus by general control, especially co-culture, leading to a better understanding of chemical bioactive diversity, and pave the way for drug discovery in neurodegenerative illnesses and biogenic pesticides.

高等真菌，无论子实体还是发酵液，都是寻找结构新颖、活性显著的药物先导化合的重要资源之一。子实体生长季节短，产量少，易腐烂，采集费用高，因此利用发酵获得次生代谢产物已经是高等真菌化学的热门领域。但是在实验室条件下，高等真菌发酵过程中所产生的次生代谢产物结构多样性有限，究其原因是很多基因在常规培养条件下保持沉默或者活性很低。因此，激活沉默基因是丰富高等真菌次生代谢产物化学多样性的重要策略。我们前期研究发现黑蛋鸟巢属（Cyathus）发酵时可以产生一系列具有神经营养活性的鸟巢烷型二萜类化合物，并且这一菌种不同发酵条件，以及在与植物病原菌共培养的条件下，可以激活不同基因，产生更丰富的代谢产物。通过共培养产生的代谢产物对病原菌有显著的抑制活性。本项目旨在应用“宏观调控”以及共培养的策略，激活黑蛋鸟巢菌的沉默基因，增加代谢产物的化学多样性和生物活性多样性，为治疗神经退行性疾病和寻找生物源农药奠定基础。

本项目，采用了“宏观调控因子”和共培养等策略，成功的激活了鸟巢菌的沉默基因，得到了更丰富的化学多样性和生物活性多样性。鸟巢菌在民间又被称为鸟巢菌，属于鸟巢菌科高等真菌，过去的研究发现，其特征性的次生代谢产物是5/6/7三环系的鸟巢烷型二萜，这类二萜被报道有广泛的生物活性，而其中最受人关注也是最有开发前景的是其神经营养活性。本项目资助的研究，从三种鸟巢菌液体培养基（包括共培养）和大米固体培养基中共分离鉴定了四十七个次生代谢产物，包括三十三个鸟巢烷型二萜，既有文献报道的5/6/7三环系的，又有较新颖的3,4-裂环和4,9裂环鸟巢烷型二萜。所有化合物平面结构都是通过核磁共振谱图和高分辨质谱确定的，而部分化合物的绝对构型，依靠ECD计算确定的。大部分鸟巢烷型二萜都具有一定程度的依赖神经生长因子（NGF）的促进突触生长的活性，其中三个二萜还具有抗神经炎的活性。深入研究表明，是通过抑制诱导型的一氧化氮合酶（iNOS）和2型环氧酶（COX-2）的活性，体现抗炎活性的。分子对接实验发现这类化合物可以和iNOS活性部分有结合，结合能较低。神经炎也越来越多的被证实与神经退行性疾病的发生发展有密切的关系，例如阿尔兹海默病。在隆纹黑蛋鸟巢菌和番茄灰霉的共培养发酵液中，还以较高的产率分离得到了一个羽扇豆烷型三萜，epistriatic acid。活性研究表明该三萜具有优于阳性对照的α-糖苷酶抑制活性，分子对接也证明了其与α-糖苷酶活性位点有作用。并给出了可能的结构改造位点。本项目资助的研究还有另一个发现，首次从鸟巢烷中分离得到了新的drimane烷型倍半萜，并且发现这类倍半萜也有一定程度的神经营养活性。这为后续研究提供了新的思路和思考，也为构效关系的探讨提供了新的参考。针对以上成果总结如下：该项目圆满完成了计划中的研究内容和目标，成功的构建了神经营养活性二萜库，并发现了其抗神经炎的活性，为开发治疗神经退行性疾病新药提供了新思路；意外的发现了一个能够大量获得的，良好的α-糖苷酶抑制剂，为开发代谢性疾病的新方案奠定了基础。