AtKP1与VDAC互作在线粒体功能中的作用研究

线粒体是真核生物进行有氧呼吸、合成ATP的重要细胞器。申请人以往研究工作证明，植物特有的微管马达动蛋白AtKP1特异定位于线粒体，AtKP1通过C-端尾区与线粒体外膜电压依赖性阴离子通道蛋白VDAC发生互作，AtKP1突变体种子在低温下表现出萌发强势。本项目拟在以往工作基础上，利用人工重组膜研究AtKP1对VDAC通道活性的调节作用；观察AtKP1和VDAC的T-DNA插入突变体表型变化；分析AtKP1突变对线粒体ATP合成、转运及产热的影响规律；测定不同低温条件下突变体和野生型植株中细胞色素氧化酶（COX）、交替氧化酶（AOX）、解偶联蛋白（UCP）的转录水平及线粒体呼吸速率的变化。在细胞、生物化学和分子生物学水平研究AtKP1与VDAC互作在线粒体功能中的作用，对发现植物微管马达蛋白新功能、深入揭示线粒体功能调节的分子机制具有重要的科学意义。

动蛋白是一类广泛存在于真核细胞、依赖于微管骨架的马达蛋白。在哺乳动物细胞中已经证明细胞骨架参与线粒体呼吸，但动蛋白与线粒体呼吸的关系一直不清楚。本课题证明一种植物特异的动蛋白（AtKP1）参与调节低温萌发种子的细胞呼吸。利用体外生物化学方法和体内转基因细胞检测方法证明，拟南芥动蛋白AtKP1通过尾区与线粒体外膜蛋白电压依赖性阴离子通道VDAC3特异互作而定位于线粒体；对有关突变体进行表型分析证实，atkp1和 vdac3具有相似表型，其种子在低温（4°C）下萌发时均呈现出较高的种子萌发率和氧消耗，但ATP水平明显降低；用呼吸抑制剂抑制线粒体的细胞色素氧化酶和抗氰呼吸途径，结果证明突变体中这两个呼吸途径的平衡均被打破。本研究证明植物特有的动蛋白KP1借助其尾区结构域与线粒体外膜蛋白VDAC3特异互作参与线粒体能量代谢调节，这对深刻揭示动蛋白的功能以及植物种子在低温萌发环境中的呼吸调节机制具有重要科学意义。.为了进一步研究KP1对VDAC3的作用作用机制，本项目还构建了全长KP1蛋白KP1-FL以及一系列KP1 C端50 AA多肽片段：KP1-C888-937、KP1-C938-987、KP1-C988-1037、KP1-C1038-1087。实验表明，KP1-C988-1037、KP1-C1038-1087可以通过VDAC3结合到线粒体上。同时对线粒体膜电位、ATP生成等一系列生理指标的测定显示：KP1-C1038-1087通过与VDAC3的互作调控了线粒体膜电位的升高，这一升高的H+梯度驱动ATP合酶，使线粒体的ATP生成量提高。