东北大豆根瘤菌噬菌体基因多样性研究

Bacteriophages are the most abundant biological entities in the biosphere, and play important roles in regulating the succession of host communities, biological evolution and biogeochemical cycling. Recently, the researches on viral ecology going very rapidly and getting much eDNA, indicating the genetic diversity and distribution character in different environments. However, limited studies focus on the relationships between virus and bacterial host, especially between rhizobiophage and rhizobia. Therefore, in this project, the cultural methods and molecular biological technique will be used to reveal the phylogenetic diversity of rhizobiophage. In addition, the g23 which encodes the major capsid protein of T4-type bacteriophages was choosing as objective gene for their ubiquitous and more abundant in different environment, and the length and diversity characteristics of rhizobiophage will be analysed by pulsed field gel electrophoresis and random amplified polymorphic DNA methods. Meanwhile, the effect of rhizobiophage on the nodulation, nitrogen fixation and yield of soybean will be studied by pot experiment. In this study, the groups of bacteriophage infecting rhizobia will be identified, and genomic characteristics of rhizobiophage and the corresponding relationships between rhizobiophage and rhizobia will be examined. Thus, the results will provide scientific evidences of how to assess the evolution of rhizobia genome and protect them.

噬菌体是生物圈中数量最多的生物，在控制宿主群落演替、生物进化和地球生物化学循环中起到重要的作用。目前关于噬菌体生态学的研究，多是基于解析环境中eDNA基因序列，虽然揭示出部分噬菌体家族的基因组成及分布特征，但噬菌体与宿主间的相互关系尚不明晰，特别是针对噬菌体与大豆根瘤菌间侵染关系的研究还是空白。为此，本研究采用培养和分子生物学相结合的方法，对侵染不同基因型根瘤菌获得的噬菌体，扩增T4型噬菌体的结构基因g23进行系统进化分析，并采用脉冲场凝胶电泳PFGE和限制片段长度多态性RAPD技术分析噬菌体全基因组大小和多样性，同时利用盆栽试验接种根瘤菌和噬菌体，明确噬菌体对大豆结瘤、固氮及产量的影响。该研究将明确侵染大豆根瘤菌的噬菌体类群，揭示大豆根瘤菌噬菌体的遗传基因特征，解析噬菌体与根瘤菌间遗传基因多样性的关系，为东北大豆根瘤菌遗传资源演化及资源保护提供科学依据。

噬菌体是生物圈中数量最多的生物，在控制宿主群落演替、生物进化和地球生物化学循环中起到重要作用。根瘤菌噬菌体侵染后导致结瘤量减少，固氮作用减弱，进而引起作物产量下降，但针对根瘤菌噬菌体的研究还鲜有报道。本项目以3株根瘤菌模式菌株（Sinorhizobium meliloti USDA1002T、Sinorhizobium sojae CCBAU05684和Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110）为宿主，采用双层平板培养法从土壤环境中分离噬菌体，利用透射电子显微镜鉴定噬菌体形态特征，测定其生物学特性。同时采用PCR-克隆测序、高通量测序和比较基因组等方法，解析噬菌体遗传基因特征。研究结果表明获得的苜蓿根瘤菌和慢生型根瘤菌噬菌体均属于肌尾噬菌体科，而中华大豆根瘤菌噬菌体为长尾噬菌体科。不同宿主获得的噬菌体株生物学特性存在一定差异，与中华大豆根瘤菌噬菌体相比，苜蓿和慢生型根瘤菌噬菌体对紫外光有更强的耐受能力。9株噬菌体均在30–40 ℃和pH为6–9时具有较强的侵染活性。对中华苜蓿根瘤菌噬菌体g23基因系统进化分析结果表明，噬菌体株间相似度较高，达到98%–99%。但与可培养的ExoT-，SchizoT-，T-，和PseudoT-evens相似度较低，仅为30%–57%。系统进化分析表明，获得的3株噬菌体不隶属于目前已划分的不同环境噬菌体g23基因的分类类群。此外，慢生型根瘤菌噬菌体BDU-3全基因组测序结果显示，BDU-3基因组属于双链闭合环状噬菌体，全长121,342 bp，GC含量为61.6%。全基因组学比对发现此噬菌体与目前已报道的13株豆科根瘤菌噬菌体相似度均很低。此外，基于该噬菌体四种结构蛋白构建的系统进化分析发现，其末端酶大亚基、主要壳蛋白、底座装配蛋白J和噬菌体尾鞘单体氨基酸序列与报道的噬菌体株相似度均较低，而主要壳蛋白、底座装配蛋白J和噬菌体尾鞘单体氨基酸序列与3株慢生型根瘤菌株相似度最高，说明根瘤菌噬菌体与根瘤菌在长期的进化选择中，可能发生了基因水平移动。该研究不仅明确了侵染大豆根瘤菌的噬菌体类群，揭示大豆根瘤菌噬菌体的遗传基因特征，解析噬菌体与根瘤菌间遗传基因多样性的关系，同时也为东北大豆根瘤菌遗传资源演化及资源保护提供了科学依据。