一种植物来源的双功能蛋白N-糖苷酶/转谷氨酰胺酶的研究及其在合成糖蛋白中的应用

均一糖蛋白合成是糖蛋白功能研究和开发应用的基础。研究者在拟南芥基因组中发现一种属于转谷氨酰胺酶超家族的N-糖苷酶，重组表达时既表现蛋白脱N-糖基活性（催化酰胺键断裂），又表现蛋白交联活性（催化酰胺键生成）。我们拟对其进行原核和真核重组表达，并进行糖基化分析和获得脱糖基化真核重组蛋白。使用这些重组酶研究其活性影响因素和生化性质，阐明双重活性的主要决定条件、糖酰胺酶底物特异性、转酰胺酶酰基受体等。我们还将通过同源建模、点突变和截短突变研究重要氨基酸和两端非活性中心扩展结构域对两种酶活性的影响，揭示其催化机理。依据其所属蛋白超家族的催化机理、其可以催化酰胺键断裂和生成双重反应的事实，以及同属转谷氨酰胺酶超家族的半胱氨酸蛋白酶催化逆反应合成肽链的经验，我们推测此酶可以催化寡糖苷和肽链之间的交联反应。我们将探索通过激活底物、改变反应条件等策略实现转糖苷反应，为此酶应用于糖肽和糖蛋白合成奠定基础。

拟南芥AtPng1p是目前发现的一种特别的酶，其大肠杆菌表达成为转谷氨酰胺酶（TGase，催化酰胺键的生成、具有蛋白交联活性），而间接证据显示其在酿酒酵母表现为蛋白N-糖苷酶（PNGase，催化酰胺键的断裂，切除蛋白N-糖苷）。本课题的中心任务是通过对AtPng1p的酶学性质进行生化和分子生物学分析解释看似矛盾的两个结论。通过课题研究我们获得了两种不同活性的AtPng1p重组酶，并且AtPng1p的两种活性是由于折叠条件不同造成的，从而回答了课题申请时提出的关键科学问题，完成了研究课题的中心任务。.课题取得的具体研究进展包括：1）通过条件优化成功实现了AtPng1p的原核可溶性表达。2）证明可溶性表达的AtPng1p表现为蛋白N-糖苷酶（PNGase）活性，而没有转谷氨酰胺酶（TGase）活性；对PNGase活性进行了生化性质研究。3）发现体外复性得到的AtPng1p只具有TGase活性，而没有PNGase活性；推论具有TGase活性的AtPng1p是人工复性条件造成的，不是AtPng1p的天然活性。4）确定了两种低等植物莱茵绿藻和小立碗藓中Png1p的编码基因cDNA序列，并证明重组莱茵绿藻Png1p具有PNGase活性。5）建立了一种N-糖苷合成底物的酶法合成方法。.由于课题研究前期遇到阻碍，造成进度滞后，目前发表SCI收录的研究论文1篇，而主要研究进展已经整理成1篇研究论文投稿。另外还有部分研究进展在进行数据补充，计划在课题结题后再发表SCI收录的研究论文1-2篇。.在前期研究工作基础上，本项目的研究在两个方面还可以开展更加深入的工作：1）AtPng1p 性质的进一步研究，包括获得具有天然氨基酸序列的重组蛋白，确定AtPng1p的糖链设别特异性，通过点突变及截短突变进行催化机理研究，利用重组AtPng1p进行蛋白相互作用研究，对重组AtPng1p进行蛋白结晶和结构测定，研究其反应机理及与其它蛋白相关作用的情况。2）两种低等植物来源的Png1p的研究：两种低等植物来源的Png1p中莱茵绿藻来源的CrPng1p已经进行了成功的重组表达及活性测定，在进一步补充研究结果后可以发表；而小立碗藓来源的PpPng1p只是确定了cDNA序列，其研究还有待开展。