禽致病性大肠杆菌RyhB调控靶点及影响感染上皮细胞应答基因的筛选

RyhB is known currently not only as a kind of sRNA which may regulate the largest number of bacterial target mRNA but also as a key component of bacterial regulatory networks. Base On constructing the RyhB gene-deleted APEC strains(△RyhB) and gene-replied strains(△RyhB-comp) and according to the new idea what RyhB is a key point of APEC regulatory networks, we wound reseach the two strains and parent strains as follows using analyze technology such as 2D-electrophoresis, HTS and so on. Firstly we may compare of bionomics among three strains and then screen the gene/protein targets in APEC regulated by RyhB. Secondly we wound construct the experimental modle of chicken trachea epithelium cells (CTECs) infeced by the three strains in vivo or in vitro, respectively and compare of the damage differences among the cells. Firstly we wound screen the .response Gene of the infected-cells effected by RyhB.

RyhB是目前己知调控细菌靶mRNA数目最多的sRNA，项目组在前期成功构建禽致病性大肠杆菌（APEC）基因缺失株△RyhB及回复株△RyhB-comp并证明RyhB的基因缺失可引起APEC多个关键毒力因子差异表达的研究基础上，依据RyhB是APEC致病性调控网络关键点的新思路，以上述两株菌及亲本株为研究对象，应用二维电泳、高通量测序等技术，比较三株菌生物学特性的差异，筛选RyhB调控APEC的下游靶点（靶基因/蛋白）并预测调控通路；继而建立三株菌体、内外感染鸡气管上皮细胞的实验模型，比较细胞损伤差异，筛选差异表达的感染细胞应答基因并预测调控通路，该研究结果将为揭示RyhB调控APEC致病性的分子机理提供研究支撑。

本项目针对小分子RNA（RyhB）与禽致病性大肠杆菌（APEC）致病性关系密切但其致病机制不明确的状况，开展APEC-RyhB对源细菌下游调控靶蛋白筛选及感染宿主细胞效应的影响研究，获得如下成果：（1）成功构建ryhb的缺失株及回复株，生物学特性评价发现RyhB基因的缺失导致APEC的生物膜形成能力、鞭毛形成能力、毒力基因转录水平、APEC黏附和入侵CEF细胞的能力、耐碱性减弱,组织载菌量、LD50显著性的降低；环境耐受力中热应激、耐酸性出现增强。为进一步研究RyhB对APEC毒力机制的调控奠定基础。（2）蛋白质组学技术筛选受RyhB调控的差异表达基因，获得显著性差异基因62个，其中Omsc、Galu、Nlpe、Tata、GmhA、proX、inFA、cysE可能是RyhB直接调控的毒力相关基因，为筛选RyhB调控的靶基因提供数据。（3）原核表达载体构建cysE蛋白，验证其是受RyhB调控的毒力相关基因，为进一步绘制RyhB对APEC的调控通路提供研究依据。（4）建立了APEC原始株（AE17）、敲除株△RyhB与HD11共培养模型，进行细胞存活率检测、台盼蓝染色发现APEC原始株（AE17）及敲除株△RyhB与HD11细胞共培养0.5h及2h比较，敲除株△RyhB组的HD11细胞存活率上升，这一趋势在2h共培养时间段更明显；同一时间段，同一浓度相比出发株导致HD11细胞凋亡数量明显高于缺失株。（5）RNA高通量测序（RNA-Seq）技术对APEC及其RyhB缺失株的与气管黏膜上皮细胞共培养前后的RNA进行测序，筛选出个差异表达基因(Fold Change≥2, FDR≤0.05)，分别有 87、99、159 个基因，GO 功能注释筛选出 PTPRC、LCP1、YFV 等免疫相关基因，为深入研究雏鸡肠道免疫提供依据。（6）RNA-Seq技术筛选分析感染和未感染APEC 雏鸡小肠炎症相关基因表达的变化。GO分类结果显示，有87个差异基因得到491个 GO功能注释，基于KEGG 分析，仅有29个差异基因得到注释，涉及41个信号通路为研究炎症相关基因在APEC损伤小肠过程中所起的作用提供了参考。（7）临床分离鉴定出72株禽源大肠杆菌，分别对72株禽致病性大肠杆菌进行致病性分析及耐药性分析，致病性实验结果显示，72株禽源大肠杆菌均为禽致病性大肠杆菌；耐药基因PCR检测结果显