Myosin7A基因突变患者iPS细胞基因校正及其毛细胞功能重建的研究

So far there is no any effective and radical therapeutic approach for hereditary deafness. The intragenic suppression of deafness gene based on stem cells may be one of prospective therapeutic approaches for hereditary deafness. Therefore, it will be an effective pathway for therapy of hereditary deafness through the intragenic suppression of deafness gene in induced pluripotent stem cells (iPSCs) from deaf patient with monogenic mutation, the induction of this iPSCs to differentiate into inner ear hair cell-like cells and the reconstruction of auditory function. In this project, we will induce the normal iPSCs and iPSCs with Myosin7A gene mutation established in our lab to differentiate into inner ear hair cell-like cells and analyze the effects of this mutation on the differentiation potentials and function of hair cells. Then, we will establish an intragenically suppressed iPSC line by CRISPR-Cas9 system and examine the effects of intragenic suppression of Myosin7A on the totipotential, the committed differentiation potential of iPSCs as well as physiological-biochemical characteristics of iPSC-derived hair cells. Finally, the iPSC-derived progenitors of hair cells will be transplanted into the mouse model with Mysoin7A mutation, and the effects of transplantation of derived hair cell progenitors on the restoration of auditory function will be evaluated. The key scientific aspects for this project are to recognize the effects of Myosin7A mutation on the differentiation and function of inner ear hair cells and explore the feasibility of auditory function restoration by transplantation with the intragenic suppressed iPSC-derived progenitors of hair cells.

遗传性聋病目前尚无有效根治措施，而基于干细胞的遗传校正修复突变基因功能是将来遗传性聋病治疗的有效方法之一。通过单基因突变耳聋患者诱导多潜能干细胞(iPSCs) 的遗传校正，并分化为毛细胞样细胞，实现听觉功能修复，可为遗传性耳聋的治疗提供新途径。本项目拟在已建立人Myo7A基因突变的iPSC系基础上，通过定向分化毛细胞样细胞，分析Myo7A基因突变对毛细胞分化和功能的影响。同时采用CRISPR-Cas9技术，建立Myo7A突变基因校正的iPSC系，评估聋病基因遗传校正前后iPSCs的全能性、定向分化潜能以及生理生化功能等细胞表型。最后利用相应的动物模型植入其诱导分化的毛细胞前体细胞，探索研究其修复听力功能的可行性。本项目拟解决Myo7A基因突变对iPSCs定向分化毛细胞样细胞潜能和功能的影响以及遗传校正对毛细胞功能重塑作用的关键科学问题，为单基因突变遗传性耳聋的治疗提供理论与技术基础。

耳聋是全球性的重大健康问题之一。我国目前约有 3000 万重度耳聋患者，其中约有 50%的耳聋为遗传因素所致。规避伦理问题，分化能力的全能性，无限的扩增能力，获得病人特异诱导多能性干细胞（iPSCs）的能力以及自体移植不存在免疫排斥的效应，这些种种优势都使iPSC在再生医学，疾病模型以及药物筛选等领域拥有广阔的应用前景。本项目中关于干细胞定向分化内耳毛细胞的研究为基于基因遗传性校正的听觉损伤功能重塑提供了基础。利用干细胞相关技术，并结合基因校正技术，治疗耳聋是我国社会和科学技术自身发展的重大需求。 首先，本项目成功建立了正常人iPS细胞系和Myosin7A遗传缺陷的iPS细胞系，并开展了正常人和遗传缺陷的iPS细胞定向分化内耳毛细胞的诱导，建立了iPS细胞定向诱导分化毛细胞的技术体系，对携带 Mysoin7A 基因突变的 iPS 细胞定向分化毛细胞样细胞的潜能及其功能进行了分析，为内耳毛细胞的重建修复提供了良好的理论基础。另外，本项目进行了Mysoin7A基因校正对iPS 细胞定向分化毛细胞样细胞潜能及其功能作用的研究。将Myosin7A遗传缺陷的iPS细胞系进行基因校正，获得了基因得到校正的iPS，用这种iPS获得的类毛细胞在形态和功能上也获得了恢复，这为通过遗传缺陷校正获得可移植的细胞来源从而用来治疗耳聋的奠定了应用基础。我们首次在体外探究了定向分化过程中分化毛细胞与支持细胞间以及毛细胞与小鼠的诱导的螺旋神经节样细胞之间的相互关系。最后，本项目探索了基因校正分化的毛细胞前体细胞体内移植修复内耳毛细胞功能的可行性。第一次将正常人C-iPSC、MYO7A遗传缺陷型P-iPSC和矫正后的CP-iPSC定向诱导分化的听上皮祖细胞移植到耳聋小鼠模型的耳蜗中，观察到移植的听上皮祖细胞进入Corti器并成功分化为毛细胞，证明了移植细胞与动物模型的自体细胞之间的细胞建立了连接关系。同时也证明了由移植细胞分化的毛细胞与小鼠自体的螺旋神经节细胞建立了突触联系，为未来成功治疗耳聋提供了有力的理论依据和坚实的实践基础。