外源性microRNA通过HuR和AUF1在转录后水平调节VEGF mRNA稳定性的研究

Angiogenesis is the core issue of tissue transplantation, stem cell transplantation promotes vascularization is promising for clinical application. However, a series of problems for stem cell transplantation is involved in acute inflammation , limited capacity to differentiation, and ethical constraints. In order to break the bottleneck for stem cell transplantation, non-cells induction system is a currently better treatment strategies for promoting vascularization. Our previous study found that adipose derived stem cells(ADSCs) induced human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) to proliferate, migration and tube formation by indirect coculture. Its supernatant is rich in exosomes containing microRNA. Because the RNA binding protein (RBP) HuR and AUF1 being in cytoplasm has a very important significance for keeping mRNA stability, mediating cell proliferation. So we put forward a hypothesis that exogenous microRNA from ADSCs regulate VEGF mRNA stability together by HuR and AUF1 at the post transcriptional level, promoting angiogenesis. Therefore, we plane to establish in vitro model that exogenous microRNA being used to induce proliferation and tube formation of HUVECs which is knockdown the endogenous microRNA to testify our hypothesis.

血管新生是整形外科各种组织移植相关基础研究的核心问题，干细胞移植促进移植组织血管化具有临床应用前景，但是面临异体细胞导致的急性炎症反应，分化能力有限，以及伦理学限制等一系列的问题。为了突破瓶颈，研究无细胞诱导系统促进移植组织血管化是当前较为实用的策略。我们前期研究发现，脂肪干细胞与脐静脉内皮细胞（HUVECs）间接共培养可以诱导HUVECs增殖、迁移和管腔形成，其培养（条件）上清中富含包含microRNA的外泌体。由于RNA结合蛋白（RBP）HuR和AUF1在细胞质中对血管形成因子的mRNA稳定性具有重要的意义，因此提出假设：脂肪干细胞来源的microRNA通过HuR和AUF1在转录后水平调节VEGF mRNA稳定性，促进血管新生。为此，拟通过抑制HUVECs内源性microRNA，应用脂肪干细胞条件上清建立外源性microRNA诱导HUVECs增殖、迁移和管腔形成的体外模型来验证假设

研究背景：血运建立、血管新生是组织移植基础研究的核心问题，干细胞技术为此提供新思路并具有临床应用前景，外泌体是近年干细胞研究的新热点，既往研究结果显示外泌体参与机体多种病理生理过程，并且在组织器官损伤的修复以及促进血管生成方面都有效果。因此，研究干细胞外泌体对移植物血管化的促进作用及机制将为临床上提高组织移植成活提供新的治疗方向和思路。.主要研究内容：1.分离、培养、鉴定ADSCs，收集外泌体，与HUVECs共培养，探讨其对HUVECs增殖、迁移、成管的影响。2.ADSCs经过氧化氢刺激，提取不同条件外泌体与HUVECs共培养，观察其对HUVECs增殖、迁移、成管的影响，检测外泌体miRNA差异性表达情况。3.建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注模型，注射不同来源的外泌体，观察皮瓣存活、血流灌注、血管新生、炎症细胞浸润、凋亡的情况。4.收集低氧环境下ADSCs分泌的外泌体，检测低氧、常氧两种外泌体以及脂肪组织标本中因子的表达。5.建立裸鼠移植人脂肪的动物模型，注射低氧及常氧两种外泌体，检测脂肪团周围血运情况、标本中血管内皮细胞的数量、病理情况、脂肪细胞的活性。6.构建稳定过表达HuR/AUF1基因的HUVEC细胞株，与外泌体共培养，观察各组HUVECs增殖、迁移、成管能力的差异，检测各组HUVECs VEGF-a表达。.重要结果及科学意义：1.ADSCs来源外泌体促进HUVECs增殖、迁移及管腔形成。2.过氧化氢预处理后获取的外泌体提高HUVECs迁移及管腔形成能力，上调p-AKT及VEGFR Ⅱ蛋白表达水平，注射入缺血皮瓣能提高皮瓣存活面积、血流灌注量及血管新生，降低炎性细胞浸润。3.与常氧条件相比，低氧微环境下产生的外泌体平均直径大、成血管相关因子表达量增高；人脂肪颗粒与之共移植后，再吸收率下降，活性脂肪细胞数量增多，炎性细胞浸润、纤维化、油嚢形成减少，移植物周围早期血运恢复加快，标本内毛细血管生成增多。4.与野生型HUVECs相比，各组HUVECs与外泌体共培养后，HuR过表达组的增殖、迁移、成管能力增强，而AUF1过表达组减弱，这与各组HUVECs VEGF-a的表达成正相关。