酵母prion蛋白Ure2的功能及其Grx活性的催化机制研究

酵母prion蛋白Ure2由N端prion结构域和C端功能性结构域组成，在酵母体内具有抗氧化应激和重金属离子毒性的功能。Ure2的C端结构域含有一个和谷氧还蛋白（Grx）空间结构非常相似的硫氧还蛋白样亚结构域，而经典的Grx是非常重要的细胞内抗氧化应激酶类。我们已有的研究发现，Ure2具有一系列Grx相关的功能和活性。经典的Grx活性由其活性中心的CXXC/S基序所催化，而Ure2并不含有Cys残基，是一种不依赖于Cys或自由巯基的非典型Grx。这里，我们将研究Ure2的Grx活性催化反应的具体步骤和反应中间体与Ure2之间的相互作用和电子转移机制，并在Ure2的活性中心构建CXXC/S基序，研究突变体的活性变化，从而阐明Ure2的Grx活性的催化机制。还将建立酵母体内筛选系统，探索Ure2在酵母体内的生理学底物，研究其生理功能及其分子机制。

Ure2是酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的一种prion蛋白，它决定了酿酒酵母的prion状态 [URE3]。Ure2通常以二聚体的可溶态存在，每个单体包括两个部分：N端1-90位是一段柔性的无折叠结构，它决定了prion状态的生成，并且在Ure2的体外成纤维过程中起着决定性作用；C端是一个球状结构域，起初被发现其在酵母的氮代谢调控中起着重要作用，并且与谷胱甘肽巯基转移酶在三维结构上有着一定的同源性。由于其三维结构上所含有的硫氧还蛋白亚结构域，Ure2被证明具有利用底物谷胱甘肽（GSH）还原巯基-二硫键的谷氧还蛋白活性。在典型的谷氧还蛋白酶活性中心中均含有CXXC（S）基序，为催化所必须；而Ure2并不含有这一序列，因此它代表了一种新颖的谷氧还蛋白酶。为了研究Ure2的催化机理，我们在其活性序列引入典型的CXXC（S）序列；在研究这一系列的活性序列突变体的过程中，发现CPNS突变体展现了一些不同寻常的特性：首先它改变了野生型Ure2所具有的对底物GSH的协同性，暗示其活性序列的改变可能导致了附近结构的某些变化；其次，CPNS突变体展示了高出野生型Ure2 六到七倍的脱氢维生素C还原酶的活力（DHAR），这一点暗示Ure2与单硫谷氧还蛋白家族具有更高的同源性。我们得到了Ure2/CPNS突变体的晶体结构，将其与野生型Ure2比较发现其活性中心区域柔性的变化很可能是改变Ure2/CPNS酶学特征的原因。另外我们比较了Ure2与来自大肠杆菌Escherichia coli的两种GST蛋白YfcG和YghU，通过三维结构上的分析以及构建并研究某些关键残基突变体的酶学性质，我们认为Ure2很可能与YfcG以及YghU同属于一类GST家族。