基于DNA末端保护与核酸外切酶Ⅲ信号放大技术的均相免疫分析方法及其在独脚金内酯检测中的应用研究

Homogeneous immunoassay methods have attracted great of interesting since they are easier and more rapid. However, the sensitivity of homogeneous immunoassays needs to be further improved. Here, we are planning to establish a high sensitive homogeneous immunoassay method based on the terminal protection of small molecule-linked DNA and exonuclease III (Exo III)-aided signal amplification. When an antibody binds to the antigen linked to the terminal of DNA, the DNA is protected from degradation by Exo III. Thus, the immunoassay signal is translated into the output of DNA detection, and the signal amplification methods for DNA detections can be involved to improve the sensitivity of homogeneous immunoassays. Therefore, we couple terminal protection of DNA and Exo III-aided signal amplification to develop a homogeneous immunoassay, in which the immune reaction and signal amplification take place simultaneously, avoiding the tedious operation while realizing the sensitive detection of proteins and small molecules. On the bases of research, we further develop a homogeneous immunoassay for strigolactones. We use the analog GR24 that is the most structurally similar to the family of strigolactones as the hapten to prepare polyclonal antibody that has class specificity against strigolactones. Subsequently, a homogeneous immunoassay based on terminal protection of DNA is established, and realizes the simple, rapid and high sensitive homogeneous detection of strigolactones. We will make a comparison between the developed method and ELISA method in operability, sensitivity, linear range, and so on, in purpose of providing important tool for strigolactones determination in the physiological studies.

均相免疫分析方法因比传统免疫分析操作更简便、更快速而受到关注，但其灵敏度有待进一步提高。本项目拟建立基于DNA末端保护和核酸外切酶III（Exo III）辅助信号放大的高灵敏均相免疫分析方法。当连接在DNA末端的抗原与抗体结合，DNA受到保护，免于Exo III的降解。据此，免疫检测转换为DNA检测信号输出，并可将DNA检测信号放大技术应用于免疫检测中，从而提高均相免疫分析的灵敏度。我们将DNA末端保护与Exo III辅助信号放大技术耦合，使免疫检测和信号放大同步进行，避免繁琐的操作，实现蛋白质和小分子的高灵敏均相免疫检测。在此基础上，以独脚金内酯类似物GR24为免疫原分子，制备具有独脚金内酯“类特异性”的抗体，用于建立独脚金内酯的均相免疫分析方法，并与ELISA分析方法进行多方面比较，实现独脚金内酯简便、快速、高灵敏的免疫检测，为独脚金内酯生理作用研究提供重要的技术支撑。

免疫分析方法是生化分析与生物传感中的主要技术手段之一，虽然传统的ELISA方法灵敏度高、适用性广，但存在操作耗时耗力的缺点。因此，均相免疫分析方法引起了研究者们的注意。然而，均相免疫分析方法的灵敏度有待进一步提高。随着信号放大技术的发展，连接小分子的DNA末端保护法使蛋白质、小分子的检测，以及抗原、抗体的均相免疫检测都可转换为单链DNA的检测信号，并可将现有的DNA传感器和DNA检测信号放大技术应用于检测当中，实现蛋白质、小分子均相免疫检测的信号放大，如独脚金内酯的免疫检测。因此，我们结合已有的研究基础，在这方面做了系列研究，包括简化探针的制备；学习结合诱导DNA组装技术，构建Exo III酶切循环放大的结合诱导DNA组装技术等。此外，我们合成了胺基功能化的GR24，并制备成全抗原，用于独脚金内酯抗体的制备，实现了GR24的ELISA分析。除了项目既定的研究计划，我们还进行了一些拓展研究，如均相免疫荧光分析中荧光材料的研究；荧光能量受体的制备和比较；抗体制备技术的研究等。研究结果表明，新的探针和新的荧光材料均能较好地实现基于末端保护的荧光分析方法，且我们构建的Exo III酶切循环放大的结合诱导DNA组装技术，可在1.6 fmol/L~16 pmol/L的范围内实现蛋白的高灵敏检测，为均相免疫分析奠定坚实的基础。而我们制备的GR24多克隆抗体通过ELISA分析，在10 ~200 nmol/L的浓度范围内实现GR24的定量测定。在此基础上，后续只需制备GR24连接的DNA探针，我们便可依据构建的末端保护分析方法实现独脚金内酯的高灵敏均相免疫检测。我们的成果进一步推进了高灵敏均相免疫检测的研究，同时独脚金内酯的免疫分析方法使独脚金内酯的检测更简便，日后若研制成检测试剂盒，将有助于独脚金内酯生理作用及其分子机制的研究。