H-NS调控副溶血弧菌毒力因子的分子机制研究

The regulation of pathogenicity by the H-NS regulator in Vibrio parahaemolyticus is poorly understood. In this study, the lethality against mice, cytotoxicity, enterotoxicity, and hemolytic activity will be systematically characterized for the wild-type, hns mutant, and complemented mutant strains of pandemic V. parahaemolyticus. The RNAseq-based comparative transciptomics assay in combination with the bioinformatics analysis will be performed for the wild-type and hns mutant strains to identify the H-NS-dependent genes in a genome-wide manner. The real-time quantitative RT-PCR and gel mobility shift assays will be then carried out to identify the directly H-NS targets that constitute the H-NS regulon. Subsequently, the fine mechanisms used by H-NS to regulate key virulence genes will be characterized by combined use of the LacZ fusion reporter, primer extension, and DNase I footprinting technologies. The final dataset will promote us to gain a deeper understanding of regulation of V. parahaemolyticus pathogenicity by H-NS.

副溶血弧菌是引发微生物食物中毒的首要病原菌，H-NS为一个全局性的转录因子，负调控大量靶基因，但其在副溶血性弧菌致病性调控中的功能和意义还缺乏研究。本研究在系统分析野生株、hns突变株、回补株的小鼠致死活性、细胞毒性、肠毒性和溶血活性等毒力表型的基础上，用RNAseq技术进行野生株和hns突变株的比较转录分析，结合生物信息学预测，筛选可能受H-NS直接调控的靶基因，进而用实时定量RT-PCR和凝胶阻滞实验，鉴定H-NS直接调控的靶基因，这些靶基因组成H-NS调控元，从而证实副溶血弧菌H-NS是整体调控子，控制众多细胞途径。进而采用LacZ报告基因融合、引物延伸、DNA酶I足迹等实验技术，深入研究H-NS直接调控关键毒力基因的精细机制。最终将表型和基因调控实验数据结合起来，确定H-NS是如何通过调控关键毒力来实现对副溶血弧菌致病性的调控。本研究的完成将促进我们对副溶血弧菌致病机制理论的认识。

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐的革兰氏阴性弧菌，广泛分布于浅海海水及海产品中，是引发微生物性食物中毒的首要病原菌。副溶血弧菌能产生T3SS1、T3SS2、TDH、T6SS2等多种与致病性相关的毒力因子。H-NS是一种普遍存在的拟核结构蛋白，它作为一个全局性的转录因子负调控大量靶基因的转录，但其在副溶血性弧菌致病性调控中的功能和意义还缺乏研究。因此，本研究拟从毒力表型分析、比较转录组与调控元分析、H-NS对关键毒力基因的精细分子调控机制研究等方面深入认识H-NS是如何通过调控关键毒力的转录，从而控制着副溶血弧菌的致病性。首先，以RIMD2210633野生株、hns突变株和回补株为研究对象，分析H-NS对副溶血弧菌毒力表型的影响。结果显示，H-NS对细胞毒性、溶血活性、肠毒性和小鼠致死毒性均具有抑制作用。提示H-NS可能负调控副溶血弧菌的T3SS1、Vp-PAI 、T6SS2等毒力因子的表达。然后，运用RNAseq技术进行野生株和hns突变株的比较转录分析，结合生物信息学预测，筛选可能受H-NS直接调控的靶基因，进而利用实时定量RT-PCR、引物延伸、LacZ报告基因融合实验、凝胶阻滞和DNase I足迹等实验技术研究H-NS对直接调控关键毒力基因的转录调控机制。实验结果显示，H-NS 能抑制T3SS1、Vp-PAI和T6SS2相关基因的转录表达。最后，将表型和分子实验数据结合起来分析，确证H-NS通过负调控副溶血弧菌毒力基因的转录表达，从而控制着副溶血弧菌的致病性。此外，我们研究H-NS对密度感应系统核心调控子opaR转录调控的影响结果显示，H-NS只能间接激活opaR的转录，H-NS可能是通过抑制opaR的抑制子而间接激活其转录的。本研究的完成促进了我们对副溶血弧菌致病机制理论的认识。