泛素连接酶ANKIB1在炎症反应中的作用和机制研究

Ankyrin repeat and IBR domain containing protein 1 (ANKIB1) is a large protein containing a RING-IBR-RING (RBR) super protein domain. It is demonstrated that ANKIB1 associates with ubiquitin E2 conjugated enzyme UbcH5B, UbcH6, UbcH7 and UbcH8, and promotes proteins ubiquitination in HEK293 cells. It is also demonstrated that ANKIB1 interacts with tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6), the core adaptor protein of immune regulation and inflammation which has ubiquitin E3 ligase activity. These discoveries indicate that ANKIB1 is an E3 ligase likely to be involved in inflammation. In this project, the structure basis for ANKIB1-TRAF6 interaction will be investigated. Furthermore, we will focus on exploring the role and molecular mechanism of ANKIB1 in inflammation response, the primary contents include if and how ANKIB1 regulate TRAF6 and NEMO ubiquitination, TRAF6-mediated IKK/NF-κB signal pathways, and the expression of main inflammatory factors. In addition,we will further analyze the ubiquitin E3 ligase activity of ANKIB1, the significance of RING-IBR-RING domain and the conserved Cys residues, thus to illustrate the the mechanism ANKIB1 act as an E3 ligase. Systematically. The project will throw light on elucidating the functions and mechanisms of ANKIB1, and may discover new molecular targets for diagnosis and treatment of certain diseases.

ANKIB1是一种含有RING-IBR-RING（RBR）超结构域的蛋白，我们前期的研究证明ANKIB1能够结合多种泛素E2结合酶，促进HEK293细胞内蛋白的泛素化，并与免疫调节和炎症反应中的核心接头蛋白TRAF6之间存在直接的相互作用，预示ANKIB1可能通过调节TRAF6泛素化参与炎症反应。本项目将进一步解析ANKIB1和TRAF6相互作用的结构基础，并重点探索ANKIB1在炎症反应中的作用和分子机制，主要包括ANKIB1对TRAF6和NEMO泛素化的影响，以及由此对TRAF6介导的IKK/NF-κB信号通路和主要炎症因子表达的调节。本项目还将进一步验证ANKIB1的E3泛素连接酶活性，分析其RBR超结构域和保守Cys对于E3连接酶活性的意义，从而较为系统地阐明其作为E3连接酶的分子机制。项目将填补ANKIB1功能和机制研究的空白，并可能为某些疾病的诊断和治疗提供新的分子靶点。

TLR4-TRAF6-NF-κB是经典的炎症相关信号通路，TRAF6的泛素化则是本信号通路中的关键一环。我们前期的研究证明ANKIB1能够与TRAF6相互作用，推测ANKIB1可能通过TRAF6调节TLR4-TRAF6-NF-κB信号通路，从而影响炎症反应。为此我们研究了ANKIB1在炎症反应的作用及其机制，并进一步分析了ANKIB1的泛素E3连接酶活性。在HEK293细胞中，ANKIB1能够与UbcH8、UbcH10和UbcH13等泛素E2结合酶相互作用。在胞内和胞外，ANKIB1都表现出E3连接酶活性，但是胞外的活性很弱，提示ANKIB1可能是多亚基E3连接酶的一部分。ANKIB1蛋白含有3个TRAF6结合模体，免疫共沉淀实验证明含有任意一个结合模体的ANKIB1截短体都能够与TRAF6相互作用。在293T细胞中，过表达ANKIB1会显著降低TRAF6依赖的NF-κB活化。NF-κB的激活会引起多种炎症因子的表达上调，为了验证ANKIB1对炎症因子表达的抑制作用，我们采用CRISPR/Cas9技术构建了ANKIB1基因敲除（KO）的Hela细胞，并通过外显子组测序和RT-qPCR分析相关基因的转录水平。与ANKIB1野生型Hela相比，ANKIB1 KO Hela中TLR4、IL-6、TNFα的表达均大幅上调。动物实验获得了相似且更进一步的结果，与同批次出生的野生型C57BL/6小鼠相比，Ankib1 KO小鼠在饲养过程中更容易表现出慢性肠炎的症状，腹腔注射LPS（5mg/kg）后，Ankib1 KO小鼠比WT小鼠更为萎靡，ELISA和RT-qPCR实验证明，的外周血和肺泡液中，IL-1β、IL-6和TNFα三种受试炎症因子的表达水平显著上升，TLR4的转录水平同样大幅上调，免疫组化结果也显示Ankib1 KO小鼠的肺组织损伤更为严重。在ANKIB1 WT和KO Hela细胞中，前者更容易发生TRAF6的多泛素化，进一步的实验表明TRAF6的多泛素化主要是K48连接型。综合以上研究结果，我们认为ANKIB1促进TRAF6发生K48连接的多泛素化，使TRAF6发生降解，并通过目前未知的机制抑制TLR4的表达，使TLR4-TRAF6-NF-κB信号通路不易激活，从而有效减轻炎症反应的强度。因此，ANKIB1是一种炎症调节因子，在炎症相关疾病的诊疗中可能具有重要意义。