pVHL对E2F1介导的生物学功能的影响及其分子机制

VHL(von Hippel-Landau) is a classic tumor supressor, whose mutaions and dysfunction cause initiation and progression of clear cell renal cell carcinomas, pheochromocytomas and other tumours.However, the molecular mechanisms of pVHL in tumor suppression is still largely unknown. E2F1 is an important transcription factor in cell cycle control, which also have been implicated for acting its roles in DNA damage pathway. We accidently found that pVHL is a downstream gene of E2F1 and induced by DNA　damage. In addition, pVHL interacts with E2F1 to inhibit its transactivity. These primiry results not only suggest that pVHL has a novel function in DNA　damage pathway, but also indicate that E2F1 might act its role in DNA damage pathway by regulating VHL. Here, we propose to further investigate the role and molecular mechanisms of pVHL in DNA damage pathway and cell cycle progression which will reveal the cause of pVHL in tumore initiation and progression mechanistically and provide valuable guidance for diagnosis, prevention and drug screening of tumors.

pVHL是一个经典的肿瘤抑制因子，它的突变和功能异常可导致肾脏透明细胞癌、嗜铬细胞瘤以及其它器官肿瘤的发生，但是对于其中的分子机制仍很不清楚。E2F1是一个重要的细胞周期调控基因，近年来也发现它在DNA损伤途径中发挥转录调控作用。我们在前期研究中，意外发现：pVHL不仅是一个受E2F1严格调控的基因，而且受到DNA损伤的诱导，此外，pVHL还与E2F1相互结合，并抑制E2F1的转录活性。这些初始结果不仅提示pVHL可能在DNA损伤途径中具有重要的新功能，而且还表明E2F1对VHL的调控可能是E2F1在DNA损伤途径中发挥作用的重要机制。本项目拟在前期工作的基础上，深入阐明pVHL在E2F1介导的DNA损伤途径和细胞周期进程中的作用及其分子机制，可望揭示pVHL在肿瘤发生和发展过程中的作用机制，为相关肿瘤的早期诊断、预防和药物筛选提供有益的理论指导。

pVHL 是重要的肿瘤抑制因子，其突变和功能异常可导致多种肿瘤疾病的发生。E2F1是重要的转录因子，一方面，它可以促进细胞周期进程，另一方面，在DNA损伤条件下E2F1可诱导细胞凋亡的发生。在本项目中，我们揭示了E2F1对VHL的调控作用，同时发现pVHL还与E2F1相互结合，并抑制E2F1的转录活性，并对其相关机制进行了研究。主要研究内容和实验结果如下：.（1）E2F1在转录水平和蛋白水平可上调VHL的表达.我们采用启动子活性检测、染色质免疫沉淀和western blot等技术，检测了E2F1对VHL的调控作用，结果表明，E2F1在转录水平和蛋白水平均可上调VHL的表达，并确定了E2F1在VHL启动子上的关键结合位点位于-41~-34bp处。.（2）E2F1可与VHL蛋白相互结合.通过亚细胞共定位、免疫沉淀（IP）和GST-pull down实验， 我们发现E2F1可与VHL相互结合；而且结构域分析表明，VHL的α结构域和E2F1的DNA结合结构域是VHL与E2F1结合所必需的。.（3）pVHL抑制E2F1的转录活性及机制分析.通过荧光素酶活性实验，我们检测了pVHL对E2F1下游基因的调控作用，结果表明，pVHL可显著抑制E2F1的转录活性。此外，通过报告基因的荧光素酶活性检测和竞争性IP实验，我们对pVHL抑制E2F1转录活性的机制进行了分析，结果表明pVHL可以降低E2F1的乙酰化水平，进而抑制E2F1的转录激活作用。.（4）pVHL影响E2F1介导的生物学功能.一方面，本实验采用流式细胞术检测了pVHL对E2F1介导的细胞周期进程的影响，结果表明，E2F1的诱导表达可以促进细胞周期G1到S期的过渡，而pVHL的介入可以显著抑制E2F1介导的细胞周期进程。.另一方面，利用lentivirus3.7病毒载体系统，成功构建E2F1和VHL稳定敲降细胞系，并检测VHL在DNA损伤条件下对细胞凋亡情况的影响。结果表明，在DNA损伤条件下，VHL敲降后稳定DNA损伤所诱导的凋亡。..这些结果不仅提示pVHL可能在DNA损伤途径中具有重要的新功能，而且还表明pVHL对E2F1介导的生物学功能的影响，可能与VHL在肿瘤发生中的作用相关，初步揭示了pVHL在肿瘤发生和发展过程中的作用机制，为相关肿瘤的早期诊断、预防和药物筛选提供有益的理论指导。