灰树花发酵菌丝体多糖的合成及其分子调控机制

Production of functional polysaccharides from fermented edible fungi is one of the attractive and important issues worldwidely. However, some key questions including how these edible fungi to synthesize the polysaccharides, where the polysaccharides synthesized, and how to realize the over-production of the polysaccharides still lack the reasonable and convincing answers. Based on our previous conclusions, the present proposal will focus on: 1) systematically elucidating the pathway and its key control points of mycelial polysaccharide synthesis in Grifola frondosa using 13C-labeled metabolic flux analysis (MFA), HLPC-TOF/MS and real-time quantitative PCR, 2) revealing the subcellular localization of enzymes involved in polymerization of mycelial and exo-polysaccharides and confirming the cell organelle where these polysaccharides are assembled using Indirect Immunofluorescence Assay (IFA) and Immunogold Electron Microscopy (IEM), and 3) constructing and screening the G. frondosa mutants with significantly lowered exo-polysaccharide production and/or enhanced mycelial polysaccharide production by over-expression and/or gene-silence of the genes involved mycelia and exo-polysaccharide production, and comparison of the mycelial morphology, structural characteristics of mycelial and exo-polysaccharides, and fermentation performance. The outputs of the present proposal will provide a basis to reveal the fine pathway and the reasonable molecular mechanisms of mycelial polysaccharide biosynthesis, and high-efficiently produce the mycelial polysaccharide with stable quality of G. frondosa.

食用菌发酵制备功能性多糖是近年来的热点研究领域之一，但食用菌菌丝体多糖如何合成、在胞内何处合成以及如何实现过量合成等关键科学问题尚未得到明确而合理的解答。在前期诸多相关研究积累的基础上，本项目拟以灰树花为研究对象，基于代谢流量分析、HPLC-TOF-MS和实时定量PCR技术，系统解析灰树花菌丝体多糖的合成途径及其关键节点；进而，利用间接免疫荧光和免疫胶体金电镜等技术，确定多糖合成所涉主要酶系的胞内定位，判定菌丝体多糖及胞外多糖合成和聚合的场所；最后，采用代谢工程手段构建菌丝体多糖合成酶系基因过表达和/或葡聚糖合成酶基因沉默的突变体，结合其菌体形态、菌丝体多糖/胞外多糖的产量/性质以及发酵特性等变化，实现对菌丝体多糖合成的理性调控，为全面系统地阐明灰树花发酵合成菌丝体多糖的途径及其分子调控机制和高效发酵生产品质稳定的菌丝体多糖提供理论基础。

多糖一直是国内外食品乳化增稠、营养强化和免疫调节等领域的研究热点之一，其结构和功能活性等得到了较为深入而系统的研究。但有关食用菌多糖生物合成的研究，特别是多糖合成途径的解析、关键酶系的功能及其调控机制的研究还十分有限。为回答食用菌多糖如何合成、在菌体内何处合成以及如何最大化合成等关键问题，本项目以灰树花菌株GF9801为对象，取得了以下研究结论：（1）建立了灰树花反向双元启动子基因沉默技术和灰树花CRISPR/Cas9基因编辑系统；（2）首次克隆并重新注释了灰树花葡聚糖合成酶基因GFGLS (GFGLS1和GFGLS2)，GFGLS1p和GFGLS2p均为含有2个大的跨膜结构域和一个亲水性细胞质结构域的膜蛋白。证实GFGLS1、GFGLS2沉默会抑制菌丝的生长和影响菌丝体/胞外多糖的合成及其组成比例，且GFGLS2对菌体生长的贡献度大于GFGLS1。（3）首次克隆并重新注释的灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因GFUGP。GFUGPp属于UDP-葡萄糖焦磷酸化酶家族，包含一个UGPase特征功能域，在氨基酸残基103~311具有16处底物结合位点。GFUGP定位于胞内，无跨膜信号肽。明确了gfugp沉默可能会减少UDP-葡萄糖供给，进而影响菌丝体和胞外多糖的产量和单糖组成，干扰了灰树花菌体生长和发酵性能。（4）鉴于β-1,3-葡聚糖基转移酶（GEL）可能涉及葡聚糖分支糖链的形成和分支化，克隆得到全长1945 bp的灰树花β-1,3-葡聚糖基转移酶gfgel4基因。gfgel4p理论分子质量为57.127 kDa，在氨基酸残基1-25存在一个信号肽，属于分泌蛋白，含有两个完整的结构域GH72催化结构域与X8结构域，无跨膜结构域。通过构建GFGEL4基因的沉默与过表达菌株，确定了gfgel4沉默或过表达显著影响了gfugp与gfgls的转录水平，影响葡聚糖的产量，gfgel4过表达有利于其胞外葡聚糖分支结构的形成。（5）最后，较为系统地研究了灰树花β-1,3-葡聚糖合成酶调控蛋白GFRho1p的基因结构和功能。研究表明，gfRho1p分子量为20.79 kDa。gfRho1基因对灰树花的多糖合成、细胞生长、细胞壁完整性及细胞壁压力的敏感性等具有重要的调控作用。本项目所取得的研究结论将为阐明灰树花发酵合成菌丝体多糖的途径及其分子调控提供坚实的理论基础和实践依据。