新型光能捕获蛋白视紫红质在赤潮甲藻中的功能及表达调控研究

Microbial rhodopsin is a type of photoreceptor that discovered last decade. It is an energy captor that different from chlorophyll-based photosynthesis and widespread in the marine ecosystem, widely reported in marine bacteria, archaea and eukaryotic algae. It is believed to have significant effects on plankton community structure and global ocean carbon cycling. In eukaryotic algae, there is only limited report about this gene. In this project, the function and expression profile of dinoflagellate Prorocentrum donghaiense rhodopsin will be studied using algae physiology, molecular biology and electrophysiology methods. The main objectives include: 1) To identify the function of rhodopsin in P. donghaiense, laser flash-induced absorbance will be performed for this protein to reveal molecular mechanism of its energy captor system. 2) In order to detect if the energy that rhodopsin captured can be storied to be chemical energy, algae cell will be grown and study under various conditions, including low nutrient, different spectrum and photosystem blocking. 3) In order to reveal the relationship between rhodopsin protein and P. donghaiense bloom, the expression and regulation study will be performed under low nutrient as in-site of the blooming area of this species.

视紫红质是海洋系统中新发现的光能捕获蛋白，是区别于光合作用的另一光能获取系统，广泛存在于海洋细菌、古菌以及单细胞真核藻类中。在海洋浮游植物群落结构以及海洋碳循环过程中很可能起着重要作用。目前该蛋白在真核藻类中的功能和表达调控研究还比较少。本研究以我国最重要的赤潮物种东海原甲藻为代表，采用传统藻类生理研究与现代分子生物学及电生理（超短时光刺激）等相结合的试验方法，研究：1) 验证东海原甲藻视紫红质蛋白质子泵功能，研究该蛋白在光下产生瞬时电势从而捕获光能的作用，深入了解甲藻通过视紫红质蛋白捕获光能的分子机制；2) 东海原甲藻视紫红质蛋白在寡营养盐、不同的光谱以及屏蔽光合作用条件下对细胞生长的支持作用，从而探讨视紫红质蛋白所捕获的能量是否转化为化学能；3) 视紫红质蛋白的表达调控，研究在低营养盐条件下该蛋白在东海原甲藻生态位上能否支持其成为优势物种，引起赤潮爆发。

质子泵型视紫红质是海洋微生物及某些浮游植物的一种新型光能捕获蛋白，该蛋白可以在光的作用下于细胞膜内外建立离子梯度，从而驱动ATP合成酶合成ATP实现光能的捕获。本研究对甲藻视紫红质蛋白的质子泵功能以及表达调控等方面进行了深入研究，研究结果包括：（1）分离得到多种甲藻的视紫红质基因编码区域，并克隆到蛋白表达载体进行功能研究,发现低营养盐条件下视紫红质基因有助于细菌的生长。（2）对东海原甲藻在各种环境下进行培养、并进行参数测定、样品制备、样品RNA和蛋白提取、视紫红质表达水平的qPCR和Western-Blot，发现在弱光下的基因及蛋白表现为高表达。结合东海原甲藻在赤潮爆发前的孕育的条件推论该基因在透光性差的中层水域为东海原甲藻提供了捕获光能的分子基础，使其在赤潮孕育爆发阶段获取生态位优势。（3）通过转录组学及转录后调控研究发现东海原甲藻的视紫红质基因在低营养盐条件下有助于细胞的存活，该基因受到表达后调控，在低磷条件下为东海原甲藻的存活提供更多的能量。（4）以南海中北部为研究区域，通过现场航次，采集原位海水，利用兼并引物扩增克隆鉴定和宏转录组测序两种方法来探究南海中北部海区视紫红质基因的分布特征。（5）为了研究甲藻中的视紫红质蛋白的具体功能与作用机制，和其在细胞中的具体表达位置，以东海原甲藻以及链状亚历山大藻的视紫红质基因为目标基因，构建了能够表达这两种甲藻视紫红质基因的哺乳动物细胞表达系统，并在此系统中对东海原甲藻和链状亚历山大藻视紫红质进行了亚细胞定位。以上这些结果丰富了我们对海洋质子泵型视紫红质的认知。