蟾蜍接触污染物对蟾酥品质影响及分子机制研究

实验研究表明高渗透性蟾蜍皮肤所接触污染物对皮肤腺合成蟾酥具有显著影响。本项目利用现代分析手段和生物学评价方法研究污染对蟾酥药材品质的影响及分子机理。工作路径是：①通过对不同环境下（自然环境、人工模拟环境）生长蟾蜍的产酥量、耳后腺组织结构观察，蟾酥化学物质分析及毒-效性评价，重金属、农药与多环芳烃蓄积研究，分析蟾酥毒-效成分与蟾蜍体内外环境的相关性，阐明污染物对蟾酥药材品质的影响规律。② 研究关键污染物对蟾蜍甾烯的胆固醇合成路径及相关合成酶的影响，揭示污染物影响蟾酥品质的分子机制。研究结果对蟾蜍资源保护、蟾酥品质评价以及动物类药材环境安全评价工作提供基础和依据。

本项目研究了污染环境下蟾酥的品质变化。（1）采用UPLC-QTOF从蟾酥生药中鉴定出50余种蟾蜍甾烯化合物，并分离制备了10个蟾蜍甾烯类单体成分作为质控标准物质。建立四级杆串联质谱含量测定方法，比较了不同产地（黑龙江、天津、山东、河南、江苏、安徽、湖南）蟾酥中蟾蜍甾烯含量变化。（2）重点研究了常用除草剂苄嘧磺隆污染对蟾蜍的产酥量、蟾酥质量和存活率的影响。结果表明，与正常组相比较，污染组的蟾蜍产酥量无显著变化，但是分泌蟾酥的化学质量明显不同。多种游离型蟾蜍甾烯水平发生上调，结合型结合型蟾蜍甾烯的水平发生下调。（3）研究还建立了蟾蜍耳后腺蛋白提取、纯化、酶解消化、多肽脱盐的方法，采用nanoHPLC-LTQ-orbitrap质谱对蟾蜍耳后腺体蛋白酶解的多肽进行一级和二级质谱鉴定。以非洲爪蟾X. Laevis蛋白序列fasta文件为模板，经数据库搜索比对，从中华大蟾蜍耳后腺质谱数据中共鉴定肽段总数为1807个，蛋白独一肽段1141个。高可信度主要蛋白537种，其中独有多肽数≥２的蛋白为267种；所有可能的蛋白总计为2876种。在污染物处理组，蟾蜍耳后腺体中与蟾酥甾体物质形成酶：P450酶家族、甾体合成相关酶、环氧酶、胆固醇酯合成酶系、有机酸精氨酸酯合成酶、以及雌激素代谢酶、单胺氧化酶等均发生显著改变。总之，项目研究首次发现了蟾蜍接触污染物会改变中药蟾酥的化学品质。污染物通过影响耳后腺甾烯合成酶系的表达，改变了活性物质蟾蜍甾烯的表达模式。