CTPS细胞蛇组装对C2C12细胞分化的影响及作用机制

Cytoophidia are newly discovered organelles, which are filaments and compartmentation of metabolic enzymes. The first known metabolic enzyme is CTP synthetase (CTPS). At present, the research on the function of cytoophidia is still in its infancy, and the roles of CTPS cytoophidia in the proliferation and differentiation of skeletal muscle satellite cells are still unclear. In present study, the C2C12 cells will be used to explore the roles and mechanisms of CTPS on the proliferation and differentiation in skeletal muscle satellite cells. At first, the key amino acid residues of CTPS will be screened. And then, RNA-Seq and iTRAQ will be performed to screen the key genes and protein factors that are involved in the cytoophidia assembly in the C2C12. On this basis, the effects of CTPS protein and CTPS cytoophidia on the proliferation, differentiation and apoptosis of C2C12 cells were studied. Finally, we would detect the morphology and number of CTPS cytoophidia in the process of muscle damage repair in mice, to explore the roles and mechanisms of CTPS cytoophidia in C2C12 cell proliferation and differentiation. These would provide a preliminary experimental basis for illuminating the roles of CTPS cytoophidia in determining the fate of muscle stem cells.

细胞蛇是最新发现的一种细胞器，大多由代谢酶组装形成“蛇”形结构，第一个已知成分是CTP合成酶（CTP synthase，CTPS）。目前关于细胞蛇功能的研究尚处于起步阶段，CTPS细胞蛇在骨骼肌卫星细胞增殖分化过程中作用仍不清楚。本研究拟以小鼠骨骼肌卫星细胞C2C12为模型，首先筛选CTPS细胞蛇组装的关键氨基酸残基，再将CTPS基因过表达并形成细胞蛇的C2C12细胞进行转录组和蛋白质组测序，结合生物化学中CTP合成过程，挖掘参与CTPS细胞蛇组装的关键基因和蛋白因子，初步探索C2C12细胞中CTPS细胞蛇组装的分子机制。在此基础上，研究CTPS蛋白及其形成的细胞蛇对C2C12细胞增殖、分化和凋亡的影响。最后检测小鼠肌肉损伤修复过程中CTPS细胞蛇的形态和数量，探明CTPS细胞蛇在C2C12细胞增殖和分化中的作用及机制，为明确CTPS细胞蛇在肌肉干细胞命运决定中的作用提供初步的实验依据。

细胞蛇是新发现的一种无膜细胞器，大多由代谢酶组装形成“蛇”形结构，研究表明细胞蛇的形成是调节酶活性的一种方式，代谢酶形成细胞蛇结构可以减少酶活性结合位点，从而螯合酶的活性；也可能只是细胞储存酶的策略，以便容纳更多分子但不释放其活性。目前关于细胞蛇功能的研究尚处于起步阶段。第一个已知成分是CTP合成酶（CTP synthase，CTPS）。CTPS是细胞内CTP从头合成过程中的关键限速酶，控制着CTP的浓度进而影响细胞周期进程，但CTPS细胞蛇组装及其在骨骼肌卫星细胞增殖分化过程中作用仍不清楚。.本项目主要围绕CTPS细胞蛇组装及其在C2C12细胞增殖、分化和凋亡中的作用进行了详细研究，取得的研究成果如下：.1.通过生物信息学分析结合氨基酸定点突变技术，筛选出小鼠CTPS蛋白中2、3、20、294、355位氨基酸是影响CTPS细胞蛇形成的关键氨基酸，这些氨基酸其中一个突变均能阻碍CTPS细胞蛇的组装。.2. 通过Co-IP结合质谱检测，发现HSPD1，CCT2/4/5，Actr3和CDK1等蛋白可以CTPS相互作用，其中HSPD1作用效果最明显，干扰HSPD1后CTPS细胞蛇形成明显减少。初步探索了促进CTPS形成细胞蛇的关键蛋白。.3.通过干扰、过表达和定点突变技术研究了CTPS基因表达量及CTPS细胞蛇的形成对C2C12细胞增殖分化的影响，证明了干扰CTPS的表达，抑制细胞增殖，促进细胞分化，过表达则相反，促进细胞增殖抑制细胞分化。当CTPS过表达或经DON诱导后可形成细胞蛇，CTPS细胞蛇的形成促进C2C12细胞增殖抑制其分化，294、355位氨基酸突变后则无法形成CTPS细胞蛇，不能促进细胞增殖。研究结果为明确CTPS细胞蛇在肌肉干细胞命运决定中的作用提供初步的实验依据。