纳米Fe3O4负载血栓调节蛋白基因转染内皮祖细胞预防动脉成形术后再狭窄

综述文献及申请者前期研究发现：①动脉扩张形成术后再狭窄涉及内皮损伤、血栓形成和内膜增生，尽快修复受损内皮、防止血栓形成是防治再狭窄的关键；②内皮祖细胞(EPCs)具有定向归巢、高效分化的潜能，已应用于受损内皮的修复，但防止局部血栓形成的效果仍不理想；③血栓调节蛋白是血管内皮细胞膜上的凝血酶受体之一，可降低凝血酶的凝血活性、加强其激活蛋白C活性，是重要的血管内凝血抑制因子；④纳米Fe3O4磁性颗粒不仅是新型的基因载体、更是移植细胞的活体示踪剂。本项目拟①以纳米Fe3O4磁性颗粒作为载体将血栓调节蛋白基因导入EPCs，探讨其细胞生物学特性及变化；②将血栓调节蛋白基因转染EPCs移植入球囊扩张后的动脉，通过内皮修复、血栓形成、炎症反应等检测，评估其修复受损内皮、防止血栓等方面的作用，试图实现基因治疗与内皮祖细胞移植治疗的结合、达到防治动脉扩张形成术后再狭窄的目的。

PTA术后再狭窄已成为临床急待解决的问题。内皮祖细胞（EPCs）具有定向归巢至受损内皮处、抑制内膜增生并促进损伤血管再内皮化的特性，因而成为干细胞移植治疗心血管疾病的理想细胞之一。随着干细胞移植治疗研究的深入，功能基因修饰EPCs治疗血管类疾病成为研究的热点。血栓调节蛋白（TM）是血管内皮细胞表面的一种跨膜蛋白，具有强大的抗凝、抗炎、抑制血栓形成功能。我们设想局部移植TM基因修饰的EPCs可预防PTA术后损伤血管段的再狭窄，但国内外相关报导尚少。. 本实验研究主要分三部分进行。第一部分为重组质粒的构建 由于实验过程中对一些不足之处进行了调整，因此，本部分由两阶段构成。第一阶段以脂质体作为重组质粒的载体，采用基因工程方法构建重组质粒 pcDNA3.1-hTM。第二阶段以慢病毒作为重组质粒的载体，从重组质粒pcDNA3.1-hTM中提取hTM，并采用DNA重组技术将hTM基因导入pLenti6.3.MCS-IRES-EGFP慢病毒表达载体中，筛选出阳性克隆与慢病毒包装系统共转染293T细胞产生病毒颗粒。两个阶段的实验结果均表明重组质粒构建成功。第二部分为EPCs的培养、鉴定及重组质粒转染EPCs后的表达检测 密度梯度离心法分离培养兔外周血EPCs；通过免疫组化检测其CD34、vWF、KDR 等内皮系特异性抗原，通过Dil-ac-LDL 及FITC-UEA-1 双荧光染色进一步表征EPCs。Q-PCR、Western blot及流式细胞仪测定结果均显示质粒转染组EPCs内可见hTM基因高效表达；MTT法及Transwell小室检测均表明重组质粒转染后不影响EPCs的增殖及迁移活性。但以脂质体为载体的转染效率仅为10%~15%，而以慢病毒为载体的转染效率可高达92.9%。第三部分为细胞移植预防PTA术后再狭窄的动物实验研究 这一部分同样分为两个阶段，先后利用脂质体及慢病毒为载体携带hTM基因转染EPCs，利用Fogarty球囊阻断损伤段血管血流后局部移植磁性纳米颗粒（Fe2o3-PLL）标记的hTM-EPCs、单纯EPCs及等量生理盐水。术后1周损伤段血管普鲁士蓝染色及Western blot均表明EPCs能成功定植于损伤血管段，术后8周MRI及病理学检查表明hTM-EPCs较单纯EPCs能更有效地抑制PTA术后再狭窄的形成。