耐热微生物引起巴氏杀菌乳加工贮运期间品质劣变的分子机制研究

The residual heat-resistant microorganisms in pasteurized milk are important factors for quality deterioration during storage and transportation. However, due to the limitation of the technical methods in the past, the residual microorganisms and their mechanism influencing on the deterioration of pasteurized milk quality have not been clearly defined so far. This project intends to study pasteurized milk samples under different processing and storage conditions. It mainly uses metagenomics and metatranscriptomics research strategies and techniques to extract the entire microbial DNA and mRNA from each sample for PacBio SMRT 3rd Generation and Illumina 2nd Generation High-throughput Sequencing. Then the gene and transcription libraries are going to be constructed, microbial metabolic networks will be established through comparing data, annotatiing function and analyzing metabolic pathway; simultaneous the qualities including sensory and physicochemical properties of milk will be determined using electronic noses, electronic tongues, automatic amino acid analyzers, LC-Ms, GC-Ms, etc. Finally, a comprehensive analysis of the above data will be conducted by bioinformatics and statistical software, in order to elucidate the exact species and dynamic changes of residual microbes in the pasteurized milk from the metagenomic and metatranscriptomic level, as well as the role of causing the deterioration of pasteurized milk quality. At the same time, the mechanism of processing and storage conditions affecting on the activity of heat-resistant microorganisms will be revealed. It is of great significance to further study and effectively control heat-resistant microorganisms, break through technical bottlenecks and ensure product quality and safety in future.

巴氏杀菌乳中残留的耐热微生物，是贮运期间发生品质劣变的重要因素。然而，由于过去技术方法所限，残留的耐热微生物确切种类及其引起品质劣变的作用机制，至今仍不明确。本项目拟以不同加工贮藏条件下的巴氏杀菌乳样品为研究对象，主要利用宏基因组学和宏转录组学研究策略和技术，分别提取各样品中微生物全部DNA和mRNA，进行PacBio SMRT第三代和Illumina第二代高通量测序，构建基因与转录文库，通过数据比对、功能注释和代谢通路分析，构建微生物代谢网络；同时利用电子鼻、电子舌、氨基酸自动分析仪、LC-Ms、GC-Ms等测定乳样感官和理化品质变化，最后通过生物信息学和统计学软件对上述数据进行综合分析，试图探明巴杀菌乳中残留微生物的确切种类、动态变化及引起品质劣变的分子机制，并揭示加工贮藏条件对耐热微生物活性的影响规律。对于进一步研究和有效控制耐热微生物，突破技术瓶颈，保障产品质量安全，具有重要意义。

本项目采集和制备了不同牧场、不同奶牛、不同加工企业、不同杀菌条件、不同贮藏温度和时间的原料奶、巴氏杀菌乳制品1182份，分别利用电子舌、分光测色计、全自动氨基酸分析仪、傅里叶变换红外光谱仪、牛奶分析仪、电导率仪、GC-MS等技术方法，对各乳样的感官、营养、理化品质的差异和变化进行了测定分析，同时利用微生物多组学研究策略和技术等，对乳样中的微生物基因组进行PacBio三代和Illumina二代高通量测序，构建基因与转录文库，通过数据比对、GO和KEGG功能注释和代谢通路分析，构建了微生物代谢网络，同时结合乳样中微生物宏蛋白质组进行提取和鉴定分析，进一步通过生物信息学和统计学分析，探明了引起巴氏杀菌乳品质劣变的关键耐热微生物为假单胞菌属、不动杆菌属、链球菌属、类芽孢菌属、沙雷氏菌属细菌及其随贮藏、杀菌条件的动态变化规律和差异表达蛋白标志物。不同巴氏杀菌条件、不同贮藏条件的乳样中的菌群的分布比例均存在明显差异，原料乳的来源、品质和牧场环境等是其微生物种类的主要影响因素，进而阐明了巴氏杀菌乳品质劣变的作用机制，同时揭示了加工贮藏条件对主要耐热微生物活性的影响规律，筛选出了糖基转移酶、糖苷水解酶、丙酮酸代谢、酪氨酸代谢等生物标志物基因，并建立了乳源耐热芽孢杆菌CAMP快速检测技术，为进一步精准监控巴氏杀菌乳品质及其中耐热微生物，奠定了基础。.通过本项目的实施，建立了1套巴氏杀菌乳中耐热微生物快速检测方法，探明了乳中微生物群落结构及动态变化规律，进一步精准监控巴氏杀菌乳品质及耐热微生物奠定基础。发表论文20篇，SCI论文11篇，EI论文4篇。申请了国家专利9件，已授权5件，获得软著2项。在国内外会议作报告6次。荣获山东省科技进步二等奖1项，获批沈阳市重点实验室平台1个。3人次入选省市各类人才计划，共培养研究生12名，获国家奖学金、辽宁省优秀毕业生等9项重要奖励和荣誉。.综上，项目组圆满完成了计划书中规定的任务内容，达到并部分超额完成了预期成果和指标。