猪细小病毒强弱毒差异的分子基础及其宿主细胞转录效应研究

为了解猪细小病毒强弱毒毒株的分子特征及其感染ST细胞后宿主细胞基因转录的差异，本研究拟从实验室保存的国内外PPV强弱毒株和分离株入手，采用精细短链测序shut down技术，完成PPV全基因组的序列测定，分析VP1/VP2区碱基缺失、3'及5'端的十字鼓瓶颈发卡结构与病毒致病力变化的关系，探讨PPV强弱毒株致病性差异的分子基础；建立区分强弱毒的多重PCR方法，研究强弱毒株在动物体内不同组织间的分布；应用荧光定量PCR检测强弱毒各转录本在ST细胞增殖过程中的动态变化，分析强弱毒在细胞中的增殖速率与相应基因位点的关系；用SSH技术分析不同毒力PPV感染ST细胞后细胞mRNA转录差异的cDNA文库，用Northern印迹杂交和荧光定量PCR鉴定差异基因及其mRNA的丰度，了解PPV强弱毒感染细胞后宿主细胞基因转录的差异，为探究PPV毒力差异的分子机理及相关蛋白在致病中所发挥的作用奠定重要基础。

猪细小病毒病是由猪细小病毒（PPV）引起的猪主要繁殖障碍性疾病之一,尽管PPV只有一个血清型，但是PPV不同毒株在基因组结构、致病力、细胞敏感性及其影响宿主细胞转录效应方面仍存在差异。为揭示PPV强弱毒间致病机制差异，本项目选择PPV 弱毒ZH株和强毒ZJ株进行全基因测序分析，结果发现强毒ZJ株与经典毒株Kresse株同源性最高（99.4%）。ZJ株VP2在弱毒ZH株的471-472 nt之间多出 75个 nt，至于75个nt的差异是否与毒力相关，仍有待进一步研究。其次，根据强弱毒间75个 nt的序列差异，建立了检测强弱毒的荧光定量PCR方法，并利用该方法对人工感染初孕母猪后PPV强弱毒在母猪及其胎猪的体内组织分布和病毒载量进行了检测。其结果发现ZJ株感染主要感染母猪心、肾、子宫等组织，且子宫内病毒含量最高。ZJ株主要感染胎猪的心、肺和脾组织。ZH弱毒株感染母猪和胎猪后均无临床症状，病毒核酸只有在超剂量PPV感染情况下才能在心、肺、小肠、腹股沟和肠系膜淋巴结中被检测到。同时强弱毒致各脏器病变程度与各脏器病毒载量呈正相关。再次，通过SSH消减文库和基因芯片技术对PPV强弱毒感染猪睾丸细胞ST后不同时相（2 h、12 h、24 h和36 h）的差异基因转录情况进行探究，完成SSH消减文库的建立及基因芯片分析筛选。SSH、芯片及荧光定量检测结果发现，PPV强弱毒感染ST细胞后的主要差异基因涉及细胞凋亡（IL-1β、ATM、CCND3）、泛素化（UBE2Q1、UBE2D2）、G蛋白偶联受体（G protein βsubunit gene）和细胞内吞（HSP70、SMAD3）等多个通路。进一步验证以上差异基因如何调控强弱病毒与细胞互作，有望找到导致PPV强弱毒致病差异的关键基因。最后，摸索了PPV在不同细胞上的增殖规律，发现PPV强弱毒均可在猪视网膜上皮细胞（VR1BL）、ST细胞以及棉鼠肺成纤维细胞（LFB）上很好增殖，强弱毒在以上三种细胞上的CPE病变明显程度依次为VR1BL＞ST＞LFB。VR1BL培养PPV强弱毒60小时可达到最高病毒滴度，而ST细胞增殖最高滴度至少在72小时以后。细胞感染结果提示，尽管PPV强弱毒在致病力方面存在很大差异，但是在致细胞病变和病毒增殖能力方面无明差异，而且发现VR1BL细胞增殖PPV比常用的ST细胞更敏感。