鳗利斯顿氏菌VI型分泌系统FHA结构域的功能研究

本研究针对鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)VI型分泌系统(T6SS)FHA结构域功能及其作用机制问题，以鳗利斯顿氏菌Lan112、FHA结构域和FHA结构域关键位点为研究对象，综合使用生物信息学、基因突变、体内过表达、免疫共沉淀、Western blotting等实验方法，研究Lan112、FHA结构域对T6SS功能的影响，分析蛋白激酶对Lan112、FHA结构域的作用，确定Lan112、fha基因的功能及作用机制；研究环境因子对Lan112、FHA结构域磷酸化和T6SS蛋白分泌的影响，评价它们在鳗利斯顿氏菌致病过中发挥的作用。本项目预期将揭示鳗利斯顿氏菌fha、Lan112基因的功能及作用机制，项目的研究成果对于病原菌致病性研究、疾病的监测和防治具有重要意义，可以为水产疾病暴发监控提供科学依据。

本研究以鳗利斯顿氏菌为对象，克隆得到大小为519bp的T6SS标签基因hcp并体外表达得到Hcp蛋白，制备了大鼠抗Hcp血清，建立了检测鳗利斯顿氏菌T6SS蛋白分泌的方法。在致病性M3株中获得了Lan112基因的缺失突变株，但由于其T6SS功能失活，无法继续在M3中开展Lan112基因在T6SS中的功能研究。检测了T6SS在16株鳗利斯顿氏菌的分布，发现13株细菌含有T6SS标签基因hcp序列；检测了T6SS在上述鳗利斯顿氏菌中的功能活性，发现在鳗利斯顿氏菌L73、L74、MHK3和MHK7中Hcp蛋白表达并被分泌到细菌细胞外，推测T6SS在这4株菌中行使分泌蛋白的功能；在L62中Hcp蛋白表达，但是Hcp蛋白未被分泌到细菌细胞外，推测其T6SS受到抑制未能把Hcp蛋白输送到细胞外；在鳗利斯顿氏菌M3、SMW1、SMW5、SMW9、MHK6、LSV1和LSV7的胞内和胞外均未检测到Hcp蛋白。比较了M3和L73菌株T6SS的转录水平差别，发现T6SS基因簇及其相关基因在L73株的转录水平远远高于M3株。进而对致病性和非致病性鳗利斯顿氏菌进行全基因测序，发现在M3株与L73株都含有2套T6SS，染色体I和染色体II各有一套（T6SS-1、T6SS-2）。M3-T6SS-1与L73-T6SS-1相似性为98%；M3-T6SS-2与L73-T6SS-2相似性也为98%，但是同一株菌中的2套T6SS之间无相似性。M3与L73中hcp和vgrG基因的结构形式有差别，M3有2个hcp、5个vgrG，每个hcp各与1个vgrG基因连接，L73有3个hcp、5个vgrG，每个hcp各与1个vgrG基因相连。5个hcp的表达产物相似度在95%以上，且这些hcp基因并未与T6SS基因簇邻近。值得注意的是，在M3-T6SS-2上游发现1个转座子序列，这个转座子可能抑制了M3-T6SS-2基因簇表达，本研究前期是针对M3-T6SS-2开展工作。发现1个丝氨酸蛋白激酶基因、1个丝氨酸蛋白酶基因。利用体外表达的Hcp蛋白为抗原，制备了鱼用疫苗，使免疫鱼获得了较好保护效果。.已发表EI文章1篇，发明专利授权1项。.基于以上研究数据分析及实施情况，项目将继续选择具有T6SS功能活性的鳗利斯顿氏菌株，构建Lan112基因缺失突变株，结合获得的丝氨酸激酶/磷酸酶序列，阐明其功能及对T6SS功能影响。