基于真菌漆酶热稳定性的基因定点突变及其机理研究

Lignin, one of the most abundant organic polymers on Earth, is an important renewable resource but hard to degrade. Laccase, one of the most important natural lignin degradation enzymes, is supposed for applications of lignin degradation and utilization. Until now, enzyme activity and stability are the bottleneck of laccase applications. Our research team has isolated more than 10 novel laccases from high fungi for their special characteristics. A laccase from Cerrena unicolor GSM-10 manifests a high enzyme activity, extracellular secretion, and considerable high thermo-stability. In the present research, we intend to perform site-directed mutagenesis and its mechanism based on thermostability of fungal laccase. The research details are including: 1) Complete genome sequence cloning of GSM-10 laccase; 2) Site-directed mutagenesis in conserved regions for new recombinant proteins with changed thermostability; 3) Protein crystallization and analysis of recombinant laccases using vapor diffusion, X-ray diffraction, and analysis software tools. The results may preliminary reveal the thermostability sites of fungal laccases, and also manifest potential foundation for laccase applications.

木质素是自然界蕴藏量巨大、但难以降解利用的可再生资源。漆酶是自然界木质素降解酶系中最重要的一员，但酶活和稳定性等问题是其漆酶工业化开发利用的瓶颈。本团队近年来从大型真菌中分离获得10余种新的漆酶，挖掘具有优异特性的酶蛋白，其中编号为Cerrena unicolor GSM-10的菌株漆酶，具有高酶活、高胞外分泌活性和较高的最适温度等特性。本研究拟通过定点突变的手段获得影响漆酶热稳定性的关键氨基酸，并对重组蛋白进行晶体结构解析，探讨稳定性改变的机理。研究内容包括：1）克隆GSM-10漆酶全基因序列；2）对保守区序列进行定点突变，测定重组蛋白酶学特性，筛选并纯化热稳定发生改变的重组酶；3）利用X射线衍射解析蛋白质晶体结构，分析氨基酸突变位点与热稳定性改变的关系。结果将初步揭示漆酶热稳定性相关氨基酸位点，为漆酶工业化利用奠定理论和应用基础。

本研究以一色齿毛菌（Cerrena unicolor）GSM-01菌株为材料，开展培养条件、产酶特性、漆酶的分离纯化、基因克隆、重组表达研究。结果表明：1）菌丝体生长的最适碳源为麦芽糖，最适氮源为酵母浸膏，最适C/N比为10/1，最适生长因子为维生素B1，最适温度为32℃，最适pH为6.5。液体发酵研究显示，1.0 mmol/L的Cu2+对漆酶分泌有显著的促进作用，发酵液活性达到2855 U/mL。2）利用三步离子交换和一步凝胶过滤层析获得纯化的漆酶（CUL），回收率33.9%，纯化倍数30.64。该漆酶是一个分子量为63.2 kDa的单亚基蛋白，纯化的漆酶活性2.05 x 104 U/mg。采用LC-MS/MS，获得部分氨基酸序列KSTSIHWHGFFQKG。CUL的最适温度和pH值分别为45 C和pH 2.6。该漆酶被1.25-10 mM的Fe2+和Fe3+强烈抑制（抑制率39-92%），而被1.25-10 mM的Mn2+激活（激活率3-10%）。酶促动力学研究表明，CUL在pH 3.0、25 C条件下，以ABTS为底物的Km和Vmax分别为302.7 μM和13.6 μM m-1。染料降解研究表明，CUL对染料Bromothymol blue、Evans bue、Methyl orange和Malachite green具有良好的降解作用，4-24 h内降解率达到50-85%。3）CUL基因全长为2460 bp（KT188822.2）、cDNA全长1551 bp（KT188821.1），5’-端非编码区序列长度59 bp，3’-端非编码区序列长度214 bp，有11个内含子序列和12个外显子序列。内含子序列长度51-65 bp，符合典型的GT-AG规则，位于：243-302、372-427、549-599、714-772、837-889、986-1042、1200-1261、1460-1524、1582-1635、1837-1899和2135-2190。编码516个氨基酸（ALE66001.1），含有21个信号肽序列和495个成熟肽序列。成熟漆酶的预测相对分子质量为55 kDa、等电点为4.61，预测含有两个N糖基化位点，分别位于453和489。发表论文13篇，其中SCI论文9篇、非SCI外文1篇、CSCD 2篇、CSCD-E 1篇。授权发明专利2项。