适配体识别-分子马达传感器的构建及在食源性致病菌检测中的应用研究

It is one of the frontier and developing direction of estabishing ultrasensitive and intelligent biosensors to study using ATP synthase spinning molecular motor as biosensors. However, till now, the recognition elements were limited to target gene fragments and antibodies, of which the complexity and unstablity limited the further development of molecular motor biosensors. The new recognition element-aptamer will be researched in this project. There are several advantages to the use of aptamers: aptamers bind target molecules with affinity and specificity, and they are more stable, easily synthesized and modified, and cost-effective. Aptamers would be linked to subunits of ATP synthase instead of DNA probes or antibodies. The rapid detection system based on aptamer-molecular motor biosensors would be developed for high sensitive determination of pathogenic bacteria by combining the function of recognition molecule, ways of signal conversion and bioactive components. The high-throughput detection of multiple pathogenic bacteria would be further studied. This is not only laying a good foundation for expanding application of molecular motor biosensors, but also enriching the content of aptamers. It will play a positive role in improving the detection technology of pathogenic bacteria and even food safety.

研究ATP合酶旋转分子马达作为生物传感器，是当前构建超灵敏智能化生物传感器的前沿和发展方向之一。但迄今为止，所用的识别元件局限于目的基因片段和抗体，其复杂性和不稳定性限制了分子马达生物传感器的进一步发展。.本课题研究拟发展新型的识别元件-适配体，它具有能与目标分子高亲和力高特异性识别、对温度不敏感稳定性好、易于标记、成本低等诸多优势，利用其取代DNA探针、抗体，作为载体连接于ATP合酶的亚基，将分子识别功能、信号变换方式和生物活性元件一体化，构建适用于食源性致病菌高灵敏检测的适配体识别-分子马达生物传感快速检测技术体系。并在此基础上开展高通量多组分食源性致病菌同时检测的研究。不但为分子马达生物传感器的扩展应用奠定了基础，而且也丰富了适配体的内涵。该技术方法的发展对于食源性致病菌检测技术水平乃至食品安全检测技术水平的提高将起到积极的推进作用。

食源性疾病已成为全球性的公共卫生问题，其中由食源性致病菌引起的食源性疾病发病率最高，对人类健康造成了巨大威胁。传统的食源性致病菌检测方法在检测时间、灵敏度和特异性上存在一定的缺陷，不能满足日益严格的检测需要。因此，发展更为快捷，方便、灵敏度高和特异性好的检测方法对保障食品安全具有重要意义。分子马达是一种生物大分子，广泛存在于细胞内，近年来得到国内外的普遍关注，其中旋转分子马达F0F1-ATPase作为生物传感器被多次应用于食源性致病菌的检测。该马达具有灵敏度高、特异性强等特点。因此本研究以分子马达F0F1-ATPase作为信号分子，以适配体作为识别分子，构建基于适配体识别的分子马达生物传感系统，并应用于食源性致病菌的检测，主要工作内容包括：.首先，利用whole-bacteria-SELEX体外筛选技术，成功筛选得到志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的特异性适配体，其解离常数分别为5.980±0.835 nmol/L、26.23±1.96 nmol/L和5.73±9.03 nmol/L。.接着，基于适配体识别结合分子马达构建了3种生物传感系统并应用于致病菌的检测。一、以沙门氏菌适配体为识别分子，pH敏感型荧光染料F-DHPE为信号分子，构建了一种基于适配体识别-F0F1-ATPase生物传感检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。最低检测限为10 cfu/mL。该方法已成功应用于牛奶实际样品的检测。二、以副溶血性弧菌适配体为识别分子，pH敏感型荧光染料F-1300为信号分子，构建了一种基于适配体识别-F0F1-ATPase生物传感检测副溶血性弧菌的方法。最低检测限为15 cfu/mL。在此基础上以荧光量子点代替荧光染料，构建了以量子点为荧光指示物的F0F1-ATPase-适配体生物传感检测副溶血性弧菌的方法。最低检测限为5 cfu/mL。所建立方法已经成功应用于市售虾的检测。.最后，构建了5种基于适配体识别检测食源性致病菌的共性检测技术，最低检测限均小于50 cfu/mL，具有良好应用前景。.本研究将分子识别功能、信号变换方式与生物活性元件一体化，构建适用于食源性致病菌高灵敏检测的适配体识别-分子马达生物传感快速检测技术体系，该技术方法的发展对于食源性致病菌检测技术水平乃至食品安全检测技术水平的提高将起到积极的推进作用。