基于益生活性的铜藻多糖分子修饰及其调控作用机理研究

The health of the gut microflora, an important factor related to human health, has aroused the concerns of people. The search of effective natural resources to promote probiotics proliferate in the human body, has great significance for solving the problem of gut microflora. Sargassum horneri belongs to Marine algae, has a number of specific metabolic pathways and biological activities. Our previous study found that Sargassum horneri polysaccharide can boost immune enhancement and has good effects on in vitro proliferation of Bifidobacterium. SHP-B, a single component of active polysaccharide with good effect in vitro antioxidant activity, has been isolated and purified from Sargassum horneri. On this basis, this project intends to take SHP-B as the starting molecule and modify its molecular structure, with sulfating and enzymatic molecular modification methods. The polysaccharides derivatives are purified and its effects in vitro proliferation of Bifidobacterium experiment are carried out for exploring better active derivatives. Furthermore, The influences of better active derivatives on intestinal flora diversity, intestinal contents and microbial fixed value are studied by PCR-DGGE and RTFQ PCR techniques. The mechanism and structure activity relationship between the prebiotic effectiveness and structure of polysaccharide derivatives will be explored. Consequently, the results will not only provide a scientific basis on revealing the structure information about polysaccharides to stimulate intestinal prebiotic effectiveness, but also lay the theoretical basis for the application of China's rich seaweed polysaccharide resources in food.

肠道微生态的健康是关系到人类健康重要因素，已引起了人们迫切关注，寻求可以有效增殖人体内益生菌的天然资源，对于解决肠道微生态问题将具有十分重要的意义。铜藻属海洋低等藻类，具有许多特殊的代谢途径和活性作用。我们前期研究发现，铜藻多糖表现出良好的体外抗氧化作用,已从铜藻分离纯化出主链结构特征基本明确组分SHP-B,具有免疫促进和体外增殖青春双歧杆菌作用。本项目拟以此为基础，以SHP-B为起始分子，采用酶解和硫酸化为代表的分子修饰方法，对其分子结构进行改造；经分离纯化、体外增殖评价，筛选具有良好益生活性多糖；通过PCR-DGGE、荧光PCR定量等技术分析多糖灌胃对小白鼠体内肠道菌群多样性、肠道内容物和微生物定值力的影响，研究构建多糖衍生物结构与增殖益生菌活性的构效关系，探讨多糖增殖益生菌的作用机理。研究成果不仅能为揭示多糖促进肠道益生活性化学结构提供科学依据，而且丰富了海藻多糖资源在食品中的应用。

本项目到2016 年12 月为止，共发表论文6篇(SCI，IF均大于3.0)；发明专利申请3项，1项发明专利已授权，其中有2项专利仍然在审核中；培养毕业了4名从事相关方向研究生。经过多年的研究，优化了铜藻多糖的提取方法，通过酶解法提高了产物的生物活性，特别是肠道益生功能。本研究成果丰富了铜藻多糖的应用领域，为其作为一种新型的益生菌打下了实验基础。今后可以针对铜藻多糖益生元实际生产作进一步的研究。本项目的重要研究成果如下： .本研究采用铜藻全株为原料，经粉碎、95%酒精脱脂处理、经微波辅助提取、乙醇分级沉淀得到铜藻粗多糖组分，对其抗氧化活性进行了研究，表面均具有一定的抗氧化活性。以铜藻多糖组分作为研究对象，采用A103S大孔树脂对SHPS60进行脱色脱蛋白，经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sephadex G-25凝胶柱层析分离后得到铜藻多糖单一组分。采用响应面法对铜藻多糖的葡聚糖酶酶解工艺进行优化，确定生物酶法降解的最佳工艺参数为：反应温度48℃，反应pH 4.8，酶液浓度3.6%，还原糖含量为0.550 mg/mL。.采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱结合Sephadex G-25凝胶柱法对单一多糖及酶解后组分进行层析分离，得到SHPAP、SHPH1、SHPH2和SHPH3，其平均分子量分别为1.79×103KDa、78.31 KDa、21.42 KDa、10.54 KDa。各组分单糖组成基本一致，均含有葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖。多糖经酶解后基本化学结构未发生明显改变，微观结构从疏松多孔的碎片状，变为致密带有褶皱的膜状物。.SHPAP、SHPH1、SHPH2、SHPH3及SHPH3-多肽复配物的吸湿与保湿试验结果显示，复配物和SHPH3的吸湿性最好，SHPAP的吸湿性最差。开展了铜藻多糖及其酶解产物对小鼠体内肠道菌群的调节作用，通过无菌采集肠道内容物，分别测量内容物的pH、挥发性盐基态氮和肠道内五种菌（双歧杆菌、乳酸菌、肠球菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌）的数量变化，并计算小鼠肠道B/E值和益生元指数的变化。铜藻多糖具有明显的肠道益生功能，而且酶解得到的多糖组分肠道益生功能均有不同程度提升。其中SHPE 2、SHPE 3的内容物pH、挥发性盐基态氮含量等指标接近于低聚果糖，可作为一种有潜力的益生元。