蜜蜂抗寒性及抗寒机制研究

In China, there exist different varieties (lines) and artificial breeding bees showed different cold hardiness, which have become the barrier factors in the application on different bee species germplasm. Till now, litter study on cold hardiness and its mechanism of bees has been done. In this study, the following research will be carried out. First, differences of the cold hardiness of different bee species will be determined and compared through discriminating temperatures and cold hardiness measurement. Secondly, physiological and biochemical mechanisms of bees cold resistance will be study by measuring the physiological and biochemical indexes such as super-cooling point, the thermal hysteresis activity (THA), antifreeze protein content of different bee species, and comparing their variations under different temperature stress. Finally, by taking antifreeze protein as the research object, the molecular mechanisms of bees will be studied through cloning and expression of the antifreeze protein gene and its function detection, cold hardiness analyses of the bees with RNAi interference antifreeze protein genes, research on stress resistance and its mechanism on antifreeze protein in vitro, and so on. Research and application on cold hardiness and its mechanism of bees may help to better application for different bee germplasm resources and improvement for the cold-resistant capability of the bee hybrids, and also can provide a theoretical and practical basis for the reasonable bee-breeding progress and fully development of their actions.

我国分布着抗寒性存在较大差异的不同品种（系）的蜜蜂及人工选育蜂种。抗寒性差异已成为不同蜂种素材交流应用的障碍，目前尚无系统的蜜蜂抗寒性和抗寒机制研究报道。 本研究将（1）通过对不同蜂种的低温诱导识别温度及抗寒性测定和比较，确定不同蜂种的抗寒性差异；（2）通过研究不同蜂种蜜蜂和虫体的过冷却点、体内含水量、血淋巴热滞活性、抗冻蛋白含量、甘油含量、海藻糖含量等生理生化指标，以及这些指标在不同温度胁迫下的变化规律，明确蜜蜂抗寒的生理生化机制；（3）以抗冻蛋白为研究对象，通过克隆和表达抗冻蛋白基因并对其功能进行检测、抗冻蛋白基因经RNAi干涉的蜜蜂的抗寒性分析、抗冻蛋白的体外抗寒性分析及抗寒作用机理研究等，明确蜜蜂抗寒的分子机制。 蜜蜂抗寒性及抗寒机制的研究与应用，有助于不同蜜蜂种质更好地交流应用和蜜蜂杂交后代抗寒性能的提高，为合理选育蜂种、充分发挥蜂种作用提供理论依据和应用基础。

抗冻蛋白AFP是当前昆虫抗寒性研究中的热门候选基因，其可提高昆虫对低温环境的适应性以及存活率。目前，关于膜翅目昆虫抗冻蛋白及相关抗寒机制的研究未见报道。.1、本研究对不同蜂种越冬后期的过冷却点进行测定，结果发现不同蜂种的过冷却点存在显著差异，且蜜蜂的抗寒性与其过冷却点有着密切关系。对不同温度处理后中蜂和意蜂体内葡萄糖、甘油以及氨基酸含量进行测定。结果发现，在低温环境下，中蜂在依赖葡萄糖代谢的程度上高于意蜂，而意蜂体内甘油积累程度远远高于中蜂，两蜂种抗寒相关氨基酸种类和变化趋势均存在一定差异。.2、本研究对不同温度处理后的中蜂个体进行转录组分析，结果发现了501个抗寒相关的候选基因，其中包括一些抗寒相关的蛋白质家族成员（HSPs、STKs和ZFPs）。GO分析结果表明各差异表达基因参与了糖和游离氨基酸等小分子物质的生物合成和代谢。.3、利用基因克隆的方法获得中蜂和意蜂AFP基因序列，并对两蜂种该基因的表达特性进行探究。结果表明，中、意蜂抗冻蛋白的相似性在94%以上，且在蛋白结构上具有较高的相似性。两蜂种AFP基因在不同的发育时期、不同组织、不同性别以及不同低温胁迫处理中的表达均存在显著的差异。中、意蜂AFP的表达与蜜蜂体内葡萄糖、甘油以及氨基酸的浓度显著相关。中、意蜂AFP的变化将会影响体内多数的各抗寒相关蛋白家族基因的表达。.4、通过比较RNAi前后中蜂血淋巴液热滞活性以及原核表达所得AcerAFP的热滞活性测定结果，初步推测中蜂抗冻蛋白通过降低蜜蜂血淋巴液的最终结冰温度进而提高个体的抗寒性。.综上所述，蜜蜂抗寒机制主要为“小分子物质代谢+大分子蛋白表达调控”系统，而抗冻蛋白通过降低蜜蜂血淋巴液的最终结冰温度对提高个体抗寒性具有重要的作用。本研究为蜜蜂抗寒机制的后续研究奠定了理论基础，也为蜜蜂抗寒系的培育提供了新的方法。