剑麻主栽品种H.11648抽薹相关基因的克隆及功能分析

Sisal is the most important hemp crop in tropical area in China and the world. The special hard fiber from sisal leaves is used widely for many purposes. Its vegetative growth stage is 10 years or so and it will die soon after bolting and flowering. The sisal variety H.11648 is the leading variety and has been planted in China for more than 50 years. Now the phenomenon of early flowering becomes a big problem and has a serious impact on sisal production. Thus, cloning sisal bolting-related genes is of great significance to extend the economic life of H.11648. To this end, we have established the genetic transformation system of H.11648 successfully. On the above basis, this project intends to carry out the following researches: 1) To identify and do correlation analysis on specific expression of gene and protein related to bolting in the initial bolting stage of sisal H.11648 by RNA- seq and iTRAQ protein analysis technologies and cloning the most important bolting-related genes. 2）To verify the function of the bolting-related genes through the positive expression in Arabidopsis and negative expression in Agave attenuate which normally bolts after planting two years. 3) To find out the functional mechanism of bolting-related genes. The implementation of the project will help not only to improve the signaling pathways which control the plant bolting, but also to delay the bolting time and extend the sisal economic life by genetic engineering.

剑麻，又名龙舌兰麻，是我国和世界热区重要的麻类经济作物，从其叶片中获取的特种硬质纤维应用广泛。剑麻植株营养生长期10年左右，在抽薹开花后即死亡。目前剑麻单一主栽品种H.11648在我国已经使用了50多年，早花现象严重，给生产造成了重大的影响。克隆剑麻抽薹相关基因，对延长H.11648经济寿命具有重大意义。为此，我们在成功建立了H.11648的遗传转化体系的基础上，本项目拟开展以下工作：（1）通过RNA-Seq和iTRAQ蛋白质组学技术，对剑麻H.11648抽薹萌动期特异表达的基因及蛋白进行鉴定和关联分析，挖掘剑麻H.11648抽薹相关的重要基因；（2）在拟南芥中表达、和在栽种两年即抽薹的弧叶龙舌兰中抑制表达，验证所发掘基因的功能；（3）研究抽薹相关基因的作用机制。项目的实施，不但有助于完善植物控制抽薹的信号通路，也为未来通过基因工程技术推迟剑麻抽薹开花时间、延长叶片收获年限奠定基础。

一、项目的背景.剑麻是我国和世界热区最重要的麻类经济作物，从其叶片中获取的特种硬质纤维应用广泛。剑麻植株营养生长期一般10年以上，在抽薹开花后即死亡。目前剑麻单一主栽品种H.11648在我国已经使用了50多年，早花现象严重，给生产造成了重大的影响。克隆剑麻抽薹相关基因，对延长H.11648经济寿命具有重大意义。.二、主要研究内容.2.1通过RNA-Seq和iTRAQ蛋白质组学技术，对剑麻H.11648抽薹萌动期特异表达的基因及蛋白进行鉴定和关联分析，挖掘剑麻H.11648抽薹相关的重要基因；2.2验证所发掘基因的功能；2.3研究抽薹相关基因的作用机制。.三、重要结果、关键数据及其科学意义.3.1从剑麻田间，选取当年不会抽薹的剑麻植株（对照组CK）、有抽薹迹象的剑麻植株（T1）、抽薹迹象明显的剑麻植株（T2），提取RNA和蛋白质，进行转录组和蛋白组测序，寻找差异表达基因，T1与对照组相比有754个基因上调，2074个基因下调，T2与对照组相比有845个基因上调，1779个基因下调，T1与T2相比有26个基因上调，14个基因下调。通过qRT-PCR的方法验证部分基因的相对表达量，与测序结果一致。.3.2利用GO分析差异表达基因，主要分为三个类别，即生物过程、细胞组分和分子功能；利用KEGG pathway分析差异表达基因，通过对CK、T1、T2三个时期的对比，分别富集到了103、109和5种通路，其中，差异最为显著的通路分别为新陈代谢，次生代谢产物合成、以及植物激素信号转导。综合以上分析，发掘到可能与剑麻抽薹相关的基因28条。.3.3构建了剑麻 FLC（开花抑制基因)的TRV-VIGS体系，将TRV-PDS阳性菌株侵染剑麻，特异性的沉默剑麻FLC（开花抑制基因)的表达，在花原基中检测到LFY(植物花原基属性基因)的超量表达；构建剑麻CO（成花关键基因）、GA（赤霉素2氧化酶基因）的TRV-VIGS体系，将TRV-PDS阳性菌株侵染剑麻，特异性的沉默剑麻这两个基因的表达，在花原基中检测到LFY(植物花原基属性基因)的抑制表达。.3.4利用生物信息学技术，分析了抽薹相关基因的互作机制，正进行实验验证。