土壤弹尾目昆虫重金属排泄解毒机制和分子遗传标志物

土壤重金属污染日趋严重和复杂的状况要求对现有经典土壤弹尾目昆虫评价指标体系予以补充、改进和创新。途径之一是引入分子遗传特征指标。本项目以土壤Cu污染为代表，以我国华东区土壤弹尾目昆虫Onychiurus yodai为模式指示物种，研究O. yodai对重金属的排泄解毒机制，包括肠道上皮细胞溶酶体的吞噬作用、蜕皮循环的细胞凋亡过程和蜕皮频次等在重金属解毒中的作用；探明排泄解毒机制与重金属诱导的O. yodai金属硫蛋白（OyMT）及其分子遗传特征的关联；分析重金属污染与OyMT分子遗传特征的相关性或建立"剂量－效应"模型；筛选OyMT的重金属分子遗传标志物：（1）OyMT量，（2）OyMT的基因（Oymt）表达水平（mRNA）和（3）等位基因频度（SSCP和 RFLP）；构建Oymt与gfp的融合蛋白（OyMT-GFP），用于OyMT在细胞内的定位研究。为重金属分子遗传评价指标的建立打下基础

我国土壤重金属污染问题仍很严峻，且有加重和复杂化趋势，现有评价方法已不能满足需求，急需指标与方法创新，主要在敏感、特异和高效上。途径之一是在经典种群和群落指标中引入个体生物学指标。本项目以土壤弹尾目排泄系统为对象，通过对排泄系统组织、细胞和分子遗传特征变化的研究，揭示了其重金属吸收富集特征和排泄解毒机制，提出了潜在指标特征。根据项目的总体目标，有关揭示弹尾目重金属排泄解毒机制和提出相应指标特征的内容基本按计划完成，目标已基本达到；有关筛选和构建分子遗传标志物方面的内容一直在按计划进行，但目标尚未最后达到，研究还在进行中，争取一年内完成；根据需要和重要性，增加了部分内容。已取得的研究结果：（1）体内Cu富集随吸收时间上升、排泄时间下降，繁殖率与富集量呈负相关，这一过程受暴露介质、暴露时间和逃避行为影响，以逃避最为敏感；（2）中肠上皮柱状细胞顶部微绒毛、细胞线粒体、细胞核、粗面内质网和溶酶体随土壤Cu暴露发生明显变化；（3）吸收-排泄平衡过程中，少量Cu被组织吸收，吸收率为8.13%，大部分Cu由中肠蜕皮和产卵排出，排泄率63.9%；（4）在排泄解毒遗传基础上，提取了Cd诱导的金属硫蛋白（MT）RNA，同源比对遗传学法获得cDNA序列，定量PCR分析了诱导量，另方面，由蛋白透析、分子筛和FPLC系统纯化蛋白，测定分子量和氨基酸测序，确认cDNA；（5）提出了逃避，富集，柱细胞微绒毛、线粒体和溶酶体，蜕皮、肠道和卵富集，MT蛋白和mRNA等10余潜在排泄指标特征。另外，进一步完善了以往的土壤动物单物种检测平台，并开展了评价指标体系的扩展研究，包括持久性有机污染物的土壤动物不同评价终点和野外多环芳烃污染的土壤蜱螨目群落指标筛选。上述研究为生理生化和分子遗传标志物的建立、下一步生态系统指标以及室内与野外方法相结合的研究奠定了基础。