DCC受体及其RhoGTPase/MAPK信号通路在周期性牵张调控神经导向生长中的作用机制研究

Axonal outgrowth and pathfinding are critical for repair and rehabilitation of spinal cord injury. Cyclic strain can well guide and direct the way of neuritis during axonal growth, which will promote cells to migrate in certain direction. But, how the direction of axon guidance is determined by cyclic strain is still not understood. Axonal attraction and repulsion responses to growth cone led neuronal migration in extension and/or retraction, which balance is important for axonal development. Our recent study showed that cyclic strain activated Netrin-1/DCC signaling to promote axonal elongation. It suggested that Netrin-1/DCC signaling may be key signal pathway during axonal outgrowth by cyclic strain stimulation. Thus, axonal elongation and animal behavior after cyclic strain stimulation will be investigated in this study. In addition, some functional antagonist were used to block key signal pathway, it will demonstrate the role of RhoGTPase/MAPK signal pathway in cyclic strain-induced axonal growth. This project will explore the DCC related RhoGTPase/MAPK signaling in the nervous system development and the potential for future research directions. Therefore, DCC related RhoGTPase/MAPK pathway might play an unexpected role in regulation of cyclic strain-induced axonal growth in future.

脊髓损伤修复和功能重建的瓶颈问题是：再生神经元的神经突起生长无方向性，影响和下端轴突的正确对接。有研究表明牵张可定向牵引神经突起的生长方向，但其作用机制尚未阐明。神经突起的生长过程中有两种方式：向生长锥延伸和回缩，申请人认为周期性牵张可维持"伸缩平衡"、促进突起的定向生长。申请人研究表明：周期性牵张（2.5%，0.25Hz）促进细胞内Netrin-1和DCC受体表达，而DCC受体信号通路可调节神经元分化、迁移和神经突起导向生长，提示DCC受体信号通路可能是周期性牵张牵引神经导向生长的新靶点。本项目拟采用细胞和动物实验，用定位检测和反向阻断等方法，研究周期性牵张作用下：1）神经突起的生长状态和形貌变化；2) DCC受体信号通路下游分子RhoGTPase/MAPK的表达变化，探寻周期性牵张对神经突起导向生长的作用机制和关键调控分子。本项目研究将为脊髓损伤修复提供新的理论和临床指导意义。

神经元轴突导向生长对于形成突触、建立具有功能的神经网络至关重要。神经轴突导向分子Netrin-1是一类介导轴突朝特定方向迁移的分泌性蛋白，通过与其受体DCC结合，促进突触的形成。外界施加牵张力能够促进神经元的生长和导向延伸，这个过程可能与牵张力调控生长锥引起细胞骨架的重排有关系，但是具体的分子作用机制至今尚未见报道。因此，本课题着重于探讨牵张力在神经元生长过程中的作用，以及力学牵拉作用后神经元内导向分子DCC受体及其RhoGTPase/MAPK信号通路的调节机制，为脊髓损伤后神经元轴突再生提供治疗和康复的思路。.本项目主要从体内和体外实验，进行了牵拉生长的分子作用机制。采用周期性牵拉装置，对体外分离培养的新生SD大鼠乳鼠脊髓神经元进行牵拉，牵张频率为0.2Hz，牵张幅度为2.5%、5%、10%，牵张时间为1h、4h、8h、12h时周期性牵张后脊髓神经元细胞存活率，免疫荧光染色鉴定神经细胞的突起状态，通过Real-time PCR、IP、WB等检测导向分子Netrin-1和DCC的变化，以及与DCC受体相关信号通路RhoGTPase的检测。结果发现2.5%牵拉4h，促进神经细胞的轴突延伸，激活了导向分子Netrin-1/DCC的表达，并且通过RhoGTPase下游信号分子的变化，诱导神经轴突的导向生长。另外，对SD大鼠进行椎骨牵拉实验，进行牵拉后动物行为的检测和动物组织内导向分子Netrin-1和DCC的分子表达的检测，结果经过1N的椎骨牵拉后，大鼠的行为恢复正常，并且促进了组织内Netrin-1和DCC的表达。本项目基础上进行拓展研究，通过力学牵拉和力生长因子的作用，从体内和体外实验，验证周期性牵张力促进神经轴突的导向分子Netrin-1和受体DCC的表达，诱导神经突起的导向生长。进一步探索神经轴突的导向生长分子机制，通过Netrin-1和受体DCC的结合，启动了神经轴突导向RhoGTPase相关的分子作用，调节神经元之间的突触连接。.因此，周期性牵张作用激活Netrin-1/DCC以及下游相关RhoGTPase的表达调控神经轴突的导向生长，为神经修复再生提供新的思路。.