线粒体ROS在血小板储存损伤中的作用及分子机制

Platelets are allowed to be kept for only 5 days because of platelet storage lesion (PSL), and the longer storage leads to decrease of platelets viability. PSL was mainly caused by the platelet activation and apoptosis. However, how platelets in storage trigger activation and apoptosis is currently unknown. Applicant and other researchers recently reported that mitochondria play a key role in platelet apoptosis, suggesting that mitochondria may be involved in causing PSL. Our latest study found that mitochondria-targeted antioxidant could improve the quality of platelet products stored in oscillation at RT. In addition, antimycin A, a complex III inhibitor which has been reported to promote mitochondrial ROS production, accelerated the occurrence of PSL, suggesting that mitochondrial ROS may be involved in triggering PSL. Focus on these findings, the aim of this study was to 1) confirm the role of mitochondrial ROS in PSL and 2) demonstrate whether mitochondria-targeted ROS antagonists could improve the viability of stored mice platelet products through in vivo experiments and 3) explore signaling pathway from mitochondrial ROS to PSL. Expected results will help to further understand the mechanism of platelet activation and apoptosis, and provide a experimental and theoretical basis for developing novel platelet preservation solution.

血小板储存损伤（PSL）主要由血小板活化和凋亡引起，是引起血小板储存时间短、以及回输体内后活力下降的主要原因，然而，储存血小板如何引起活化和凋亡目前未明。申请人及其他研究者最近报道线粒体在血小板凋亡中起重要作用，提示线粒体可能参与引起PSL。申请人最新的研究发现，线粒体靶向的ROS拮抗剂，能改善22±2 C震荡保存的血小板质量、延缓PSL的发生；同时，采用能促进线粒体ROS产生的抗霉素A则加速PSL的发生，提示线粒体ROS可能在引起PSL中起重要作用。围绕这些发现，本课题拟进行以下研究：1）全面证实线粒体ROS在引起PSL中的作用；2）小鼠体内试验探明线粒体靶向的ROS拮抗剂对储存血小板体内活力的影响；3）从血小板活化和凋亡两个方面，探讨线粒体ROS引起PSL的分子机制。预期结果有助于进一步认识储存血小板发生活化和凋亡的分子机制，同时为研发新颖血小板保存液提供实验基础和理论依据。

本项目按计划研究了线粒体活性氧（ROS）在血小板储存损伤（PSL）中的作用。通过使用流式细胞仪和western blot等实验手段检测细胞内ROS和线粒体ROS，证实随着保存时间的延长，血小板胞内ROS和线粒体ROS浓度逐渐升高、线粒体跨膜电位发生去极化、磷酯酰丝氨酸（PS）外翻增多、P-选择素表达和PAC-1结合增多、糖蛋白(GP)Ibα酶切增多，保存血小板逐渐发生凋亡和活化；线粒体靶向的ROS拮抗剂（Mito-TEMPO）降低线粒体ROS和胞内ROS浓度、发生线粒体跨膜电位去极化和PS外翻的血小板减少，但对P-选择素表达和PAC-1结合抑制效果不是很显著；促进线粒体ROS产生的抗霉素A增加线粒体ROS和胞内ROS浓度，加速保存血小板凋亡的发生。通过使用p38 MAPK抑制剂等，研究发现p38 MAPK不抑制ROS的产生，NAC抑制p38 MAPK的活化，表明ROS产生位于p38 MAPK活化的上游。在PSL引起的GPIbα酶切过程中，ROS起重要作用，NAC抑制PSL引起的GPIbα酶切；p38 MAPK在PSL引起的GPIbα酶切过程中也发挥重要作用，p38 MAPK抑制剂抑制PSL引起的GPIbα酶切；因此，在PSL引起的GPIbα酶切过程中，可能存在ROS-p38 MAPK-ADAM17-GPIbα酶切信号通路。同时，我们通过蛋白质组学、乙酰化蛋白质组学，研究体外保存1、3、5、7天血小板的蛋白质表达谱变化和乙酰化蛋白谱的变化，目前这方面的工作正在研究过程中，有望在2017年3月底完成。另外，我们研究发现线粒体ROS在过高热和阿霉素诱导的血小板凋亡过程中发挥重要作用；线粒体通透性转换孔在钙离子载体诱导的GPIbα酶切也发挥重要作用。本项目通过对线粒体ROS的研究，证实线粒体ROS在体外保存血小板凋亡，以及过高热和阿霉素引起的血小板凋亡过程中发挥重要作用，通过使用线粒体靶向的ROS拮抗剂或能够降低线粒体ROS的药物，有望能抑制（或延缓）血小板凋亡的发生，为延长体外血小板保存时间，以及临床上血小板减少症患者的治疗提供新的视角。本项目到目前共发表标注受本项目资助的SCI期刊论文5篇，国内中文期刊论文2篇；另外，有1篇SCI期刊论文已被录用。