结核分枝杆菌RV3802C蛋白在持留感染中的作用机制研究

Today, the persistent infection mechanism of Mycobacterium tuberculosis is unclear, which is seriously hampered the effective prevention and control and treatment of the tuberculosis. In the previous study, we verified the function of Mycobacterium tuberculosis secreted protein RV3802C sub-cellular localization and analyzed it had PE-PPE homologous region (119-306aa) . Combinative secreted protein RV3802C constitutes the cell wall composition of Mycobacterium tuberculosis, suggesting that the protein has the function of holding the stay Mycobacterium tuberculosis latent infection is closely related. This project will study the secreted protein RV3802C of M. tuberculosis，which is based on the motif determine RV3802C sub-cellular localization. And then we will establish stable cell line for RV3802C's stable expression and analyze the transcriptome difference between stably expressing cell line and parental cell line. We need to analyze the changes of the NF-kB signaling pathway and in the levels of NO. We also need to study the special host protein which could interact with RV3802C protein and their characteristics. Construction of M. tuberculosis H37Rv gene mutant MT△ RV3802C and analyze the changes of gene transcriptome which is related to persistent infection. At last we will utilize guinea pig model to evaluate the changes of tissues biomass, the guinea pig survival time and histopathological changes between mutant and parental strain different time after infection. Based on the above study, the mechanism of secreted proteins RV3802C in persistent infection of Mycobacterium tuberculosis will be elucidated.

结核分枝杆菌的持续感染机制不清是严重制约结核病有效防控和治疗的重要因素。在前期工作中，我们验证了结核分枝杆菌分泌蛋白RV3802C特殊的亚细胞定位，分析RV3802C蛋白存在PE-PPE同源区；结合分泌蛋白RV3802C参与构成结核分枝杆菌细胞壁，推测该蛋白与结核分枝杆菌的持留感染密切相关。本项目以结核分枝杆菌分泌蛋白RV3802C为研究对象，在确定其亚细胞定位基序的基础上，构建稳定表达该基因的细胞株，分析稳定表达细胞株与亲本细胞株的转录组差别、NF-kB信号通路及NO含量等的变化；研究与RV3802C蛋白互作的宿主蛋白及其特性；构建结核分枝杆菌H37Rv的基因缺失突变株，分析与持续感染相关的基因转录水平变化；应用豚鼠模型评价突变株和亲本株在感染后不同时间的组织荷菌量、豚鼠存活时间和组织病理学变化。综合以上研究，阐明分泌蛋白RV3802C在结核分枝杆菌持续感染中的作用机制。

结核分枝杆菌的持续感染机制不清是严重制约结核病有效防控和治疗的重要因素。在前期工作中，我们验证了结核分枝杆菌分泌蛋白 RV3802C 特殊的亚细胞定位，分析 RV3802C 蛋白存在 PE-PPE 同源区；结合分泌蛋白 RV3802C 参与构成结核分枝杆菌细胞壁，推测该蛋白与结核分枝杆菌的持留感染密切相关。.本项目以结核分枝杆菌分泌蛋白 RV3802C为研究对象，在确定其亚细胞定位基序的基础上，开展了rv3802c基因的克隆、表达和纯化，测定了Rv3802C蛋白酯酶的活性，制备了抗Rv3802C蛋白单克隆抗体，完成了Rv3802C蛋白亚细胞定位研究、Rv3802C蛋白的晶体生长和Rv3802C蛋白RAW264.7细胞系的构建，尝试构建结核分枝杆菌分泌蛋白RV3802C基因突变株，系统分析了RV3802C的免疫效果等研究内容。在此基础上，我们又开展了14个Lip家族脂肪酶蛋白的表达、筛选工作，从中筛选出活性更高LipL蛋白，并以此开展了一系列的研究工作。.结果表明，成功表达了Rv3802C蛋白，验证了Rv3802c蛋白具有酯酶活性，证明其可降解短链底物p-nitrophenyl acetate (C2)，推测其可能在降解短链脂肪酸中发挥作用；Rv3802C蛋白具有很好的免疫原性，可诱导产生强的体液免疫和细胞免疫，因而可作为很好的亚单位疫苗候选，用于预防结核分枝杆菌感染；建立了以非致病性的耻垢分枝杆菌评价结核分枝杆菌重要功能蛋白的研究平台，为开展相关研究奠定了很好的基础；从脂肪酶Lip家族中鉴定出一个高活性脂肪酶LipL，详细分析了LipL蛋白的脂肪酶活性特征，明确了酶的活性中心为G49-G-G51基序，证实LipL是结核分枝杆菌的重要抗原蛋白，有可能在长链脂肪降解、持留感染中发挥作用。