石斑鱼网格蛋白（clathrin）介导虹彩病毒SGIV侵染宿主细胞的分子机制

Grouper, Epinepheus spp., is among the most important marine-cultivated fishes in the southern coastal areas of China and Southeast Asia, but viruses, such as Singapore grouper iridovirus (SGIV), one of the most important viral pathogens in culturing groupers and other marine fishes, have already highly threatened the health of the fish thus the sustainable development of grouper aquaculture. Based on the previous studies, clathrin- mediated endocytosis (CME) is crucial in SGIV entry, and as the marker protein of CME, clathrin plays vital role in virus infection. However, the detailed mechanisms how SGIV infects host cells through CME remain largely unknown. To reveal the mechanisms of clathrin mediated SGIV entry and then to improve antiviral drug design, we will in this study clone the grouper clathrin gene, take advantage of combined technologies to study the effect of clathrin on SGIV infection, investigate the dynamic interactions between SGIV and clathrin in living cells and in the end identify protein complex of clathrin.

石斑鱼是我国南方及东南亚各国重要的海水名贵养殖鱼类之一，病害频发严重影响其可持续健康发展，石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）是重要的传染性病原之一。我们的前期研究表明，网格蛋白介导的内吞（clathrin mediated endocytosis，CME）是SGIV侵染宿主细胞的重要途径之一。网格蛋白（clathrin）作为CME的标志性蛋白对病毒侵染有重要作用。然而，目前有关SGIV如何利用clathrin侵染宿主细胞的精细作用机制仍不十分清楚。因此，本项目拟克隆石斑鱼clathrin基因，通过多种技术研究clathrin对SGIV侵染宿主细胞的影响，及二者的动态作用过程，并初步鉴定与clathrin相互作用蛋白，从而揭示clathrin介导SGIV侵染宿主细胞的机制。研究结果将进一步阐明虹彩病毒的致病机理，并促进发展新的抗病毒策略。

SGIV可通过网格蛋白介导的内吞途径进入宿主细胞，然而有关网格蛋白，特别是CLC如何介导SGIV侵染宿主细胞的精细过程报道还很少。本研究从石斑鱼中克隆鉴定了网格蛋白轻链的两个亚型，CLCa和CLCb，其中CLCa编码202个氨基酸， CLCb编码205个氨基酸。CLCa和CLCb在脾、肾和肠等组织中均有分布，并且CLCa的转录水平高于CLCb。亚细胞定位表明，CLCa和CLCb分布于细胞质和细胞膜上，且在SGIV感染晚期，CLCa和CLCb均围绕在病毒加工厂附近。通过分别构建CLCa和CLCb的显性负性突变体CLCa-W119R和CLCb-W122R，破坏轻链与重链的结合，分析了CLCa和CLCb在虹彩病毒感染过程中的作用。结果表明，破坏CLCa显著抑制SGIV感染，而破坏CLCb对病毒感染无显著影响。利用共聚焦显微镜成像技术等方法，我们进一步发现破坏CLCa会显著抑制SGIV病毒粒子的进入及进入后向早期内体的运输，并且显著降低SGIV与微丝的共定位，但不影响病毒的黏附。然而，破坏CLCb对SGIV的黏附、进入以及与Rab5、微丝的共定位均无显著影响。同时，利用单粒子示踪技术实时追踪了SGIV利用CLCa进入宿主细胞的动态过程。以上研究揭示了CLCa和CLCb对虹彩病毒感染的不同影响，并实时追踪了SGIV利用网格蛋白进入宿主细胞的动态过程，有助于深入理解海水鱼类虹彩病毒的感染和致病机理。