基于荧光原位杂交的乙型肝炎病毒增殖过程中关键分子事件时空动态研究

As a pathogen causing grave hazards to mankind, Hepatitis B Virus (HBV) has been studied in great detail in the molecular mode of replication. Nevertheless, our current knowledge of HBV still lacks in-depth understanding on the intricate subcellular distribution of viral replicase during the whole HBV infection lifecycle. In-situ detection methods for localization of key viral nucleic acids and higher resolution microscopy would provide extended information of these key issues. Based on our previously established chromogenic in situ hybridization (ISH) method, we further upgrade it into a fluorescent in situ hybridization (FISH) assay. Utilizing this methodology, the current project aims to illuminate the spatiotemperal dynamics of key molecular events from cccDNA formation to DNA synthesis and virion maturation. In addition, this method would help to dissect the molecular steps that are targeted by nucleoside analogs and interferons. In addition, by combining the expansion microscopy (ExM) technology, super-resolution images on viral protein synthesis, capsid assembly and virus budding etc can be obtained. Finally, we would seek to validate some of the key observations in clinical specimens. The new data gained by the current project would generate additional insight into the cell biology of HBV replication cycle, which would possibly provide new clues to a complete cure of chronic hepatitis B.

作为一种严重危害人类的病原体，学术界对乙型肝炎病毒(HBV)复制模式的分子细节已有深入的了解。然而，现有研究仍缺乏对病毒复制中精细时空分布的详细分析与描述。针对病毒核酸的原位检测手段以及超分辨率显微成像技术将大大增加这方面的信息。课题组前期在基于化学显色的原位杂交(ISH)技术基础上，进一步成功开发了一套针对HBV各类核酸的荧光原位杂交(FISH)技术。本研究拟基于此，深入探讨HBV感染靶细胞后，从cccDNA形成至病毒完成复制、包装释放整个过程的单细胞时空动态，并进一步探讨核苷类似物和干扰素抗病毒药物干预下受到抑制的关键病毒学步骤。此外，结合国际上新开发的膨胀显微(ExM)技术，获得病毒蛋白质翻译、核衣壳的组装及病毒颗粒成熟这些关键步骤中的超分辨率显微图像。最后，对相关结果在临床样本中进行初步验证。本研究取得的新信息将有助于阐明HBV复制成熟的细胞生物学过程，有望为治愈乙肝提供新的靶标

慢性乙型肝炎是我国发病率高，严重影响国民健康的一种传染性疾病。慢乙肝的治疗目前虽已有有效的方案，但病毒清除率仍然较低。乙肝病毒(HBV)在一个编码能力高度受限的基因组内，通过进化发展出了一套精妙的利用宿主资源为自己复制服务的分子机制。这一病毒利用细胞分子机制的详细图景仍远未被描绘清楚。本研究通过利用基于bDNA的荧光原位杂交技术集合免疫荧光，建立了一套通过光学显微镜技术的对病毒核酸和蛋白的多重检测技术，使得探究乙肝病毒生活周期中的关键步骤成为可能。 我们确认了HBV感染复制过程中较为缓慢的动力学特征，并且发现在单细胞水平存在很强的异质性。我们直接对HBV的微小染色体以及其染色质（乙酰化组蛋白3，RNA聚合酶II）进行了荧光成像，观察到了在原代肝细胞中HBV诱导的Smc5/6复合物的降解。 我们定量分析了HBV前基因组RNA与翻译中核糖体和核衣壳的共定位。分子水平的统计分析显示一个前基因组RNA首先进入较快的翻译期，然后进入较为缓慢的核衣壳包裹和成熟期。最后，我们研究了细胞微管结构在核衣壳组装和病毒颗粒形成过程中的作用。 化合物诱导的微管解离导致核衣壳在核周的聚集，同时多囊泡复合体（multivesicular bodies）的汇合受到显著的抑制，从而抑制了成熟病毒颗粒的释放。综上所述，本研究提供了HBV在感染过程中与宿主细胞关键分子和亚细胞结构的相互作用的综合图景。我们在单细胞水平获得的异质性数据为理解病毒的复制动力学提供了独特的视角，取得了关键的分子信息。