火麻仁肽对模拟失重环境下肠黏膜派氏结T细胞免疫功能的防护作用机制研究

载人航天实践证明，航天微重力环境会造成T淋巴细胞介导的细胞免疫功能受损及肠道微生态紊乱，而通过中药、饮食等多种防护措施，可以对抗失重对航天员免疫功能的部分影响。火麻仁蛋白系从药食同源资源桑科植物大麻(Cannabis sativa L.)的种仁中分离出的蛋白，具有调节细胞及体液免疫功能。项目组前期研究表明火麻仁蛋白共有10条亚基，分子量主要分布在17000u~72000u；氨基酸分析表明疏水性及碱性氨基酸所占比例较大，其中精氨酸占氨基酸组成的16%左右，这为酶解修饰制备免疫活性肽提供了前提。本研究以此为切入点，在项目组肠道微生态及火麻仁蛋白前期研究的基础上，拟通过酶解修饰火麻仁蛋白，经分离纯化获得免疫调节活性及抗氧化活性最优的火麻仁肽，重点研究其对模拟失重条件下肠黏膜T细胞免疫功能防护作用机制，进一步研究其一级结构，阐明其免疫活性物质基础，为航天失重免疫功能防护措施的制定提供理论依据。

通过本课题研究发现，脱壳火麻仁粗脂肪及蛋白质含量分别为38.7%和30.5%；ICP-OES法测定火麻仁元素结果表明，钙、钾、镁等宏量元素含量相对较多，钠含量相对较少，微量元素铁、锰、锌含量丰富，尤其是锌元素含量比茶叶籽及松花粉高出近2倍。采用超临界流体二氧化碳对脱壳火麻仁进行低温脱脂，得到的火麻仁油脂肪酸以亚油酸和亚麻酸为主，分别占60%和24%，优于常见植物油；生育酚含量约500mg/kg，以γ-生育酚为主；火麻仁挥发性气味物质以烯类为主，其次为醇、酯及酮类。以低温脱脂火麻仁为原料，采用碱提酸沉法制备火麻仁蛋白；电泳试验表明，火麻仁蛋白亚基主要集中于22kDa-50kDa和15kDa-18kDa之间，其中在46kDa、23kDa两处谱带十分明显。通过筛选试验确定采用蛋白酶 A“天野”2SD酶解火麻仁蛋白制备火麻仁肽的条件为：酶解温度50℃，酶解pH7.0，底物浓度6%，酶用量1000u/g，酶解时间3h，得到的火麻仁肽DPPH清除率82.5%，水解度为25.6%。 . 通过尾吊大鼠模拟失重实验， 肠黏膜HE染色及免疫组化分析表明，灌胃火麻仁肽可以维持肠黏膜正常的组织形态和细胞免疫功能，对大鼠胸腺指数和脾脏指数影响不显著，提高了外周血IL-2、IL-10、CD4+、CD4+/CD8+、IFN-γ及TNF-α水平，其中CD4+及IFN-γ差异有统计学意义，提示火麻仁肽可以调节尾吊模拟失重致细胞免疫功能下降。火麻仁肽肠黏膜T细胞免疫调节机制研究表明，灌胃火麻仁肽，肠黏膜T淋巴细胞Foxp3表达水平显著下降，Trx表达水平显著上升，Trx蛋白表达水平显著增加，还原态的Trx也有所增加，提示肠道淋巴结细胞的抗氧化能力有明显增强。通过柱层析脱盐、离子交换树脂分离纯化获得了火麻仁肽的三种主要成分，通过序列测试分析，三种主要的火麻仁肽一级结构氨基酸序列分别为Ser-Leu-Leu-Arg-Val-Glu-Gly-Lys-Leu-Asp、Asn-Leu-Phe-Lys-Gly-Phe-Asn及Arg-Cys-Asn-Leu-Gly-Leu-Gly-Ser-Ala-Lys-Arg。