拟南芥MDN1-NLE调控种子大小机理的研究

Seed size is an important trait with respect to ecology and agriculture, which is known to be influenced by maternal and/or zygotic factors. Our previous work had successfully screened one mutant, sao, which has increased seed size phenotype. The mutated gene in sao is AtMDN1, which was clarified with positional cloning. The homologous genes of AtMDN1 in yeast and potato were proved to be interacted with NLE. Although increased seed size, sao is extremely stunted and dwarf. Taken together, AtMDN1 might be a regulator of maternal and/or zygotic factors. However, AtMDN1-NLE functions in seed development are still unknown. This study would clarify whether AtMDN1 interacts with NLE and functions in seed embryo, endosperm or ovule integument development. According to AtMDN1-NLE functions in 60S ribosome subunit maturation, downstream target proteins of AtMDN1-NLE will be clear based on Proteomic analysis. Furthermore, transcripts of genes which play key roles in regulating seed size will be tested. Together with genetic approaches and complement experiments, this study aims to make the molecular mechanisms of MDN1-NLE in regulating seed size clear.

种子大小是农作物的重要性状，主要由受精卵调控因子和母系遗传共同影响。本项目前期工作从拟南芥EMS诱变突变体库中得到一株具有种子变大而植株发育严重迟缓且矮化表型的突变体sao，利用图位克隆技术确定其突变基因为AtMDN1。在酵母中，MDN1同源蛋白可以与NLE蛋白互作，共同参与对60S核糖体亚基的前体出核及成熟过程。然而，目前对AtMDN1-AtNLE在植物种子发育过程中的作用仍然未知。本项目将通过免疫共沉淀技术分析MDN1和NLE的体内互作，结合突变体表型分析此两种蛋白是否共同调控种子发育，并明确其功能缺失对胚、胚乳以及种皮发育的影响。由于MDN1-NLE功能缺失可能影响60S核糖体亚基的成熟进而影响蛋白合成，本项目将通过蛋白质组学分析MDN1-NLE功能缺失所影响的下游蛋白，并检测参与突变体中的表达情况，结合遗传学手段和功能互补实验明确MDN1-NLE调控种子大小的分子机理。

核糖体生物合成依赖许多组装因子。在酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，AAA-ATPase Midasin 1（Mdn1）发挥核糖体组装因子的功能，但在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，MDN1的功能并不十分清楚。利用正向遗传学的方法，筛选到一株拟南芥突变体，其表现出多种发育缺陷表型，例如根短、种子较大但萌发率低等。利用图位克隆技术，明确此突变体是由MDN1编码区一个由G到A的点突变造成，此突变导致MDN1第3838位谷氨酸变为赖氨酸，也因此将此突变体命名为mdn1-1。序列保守性分析发现，此突变的谷氨酸在不同物种间极度保守。启动子活性分析结果显示，MDN1主要表达在细胞分裂旺盛的组织中，例如根尖分生区及芽尖等部位。转录组测序（RNA-seq）结果表明，MDN1突变影响了大量植物发育相关基因的表达。通过分析MDN1另一个由T-DNA插入造成的等位突变体mdn1-2，发现其胚胎致死，说明MDN1对胚胎发育至关重要，也同时说明可生存的mdn1-1是一个MDN1功能弱化突变体。通过观察mdn1-1的胚胎发育过程，发现其胚胎发育异常缓慢，且在球形胚阶段有较高几率发生畸形。通过观察DR5rev::GFP表达，发现mdn1-1在球形胚发育阶段生长素分布出现异常。利用FM4-64染色细胞膜，发现mdn1-1根尖分生区细胞数目显著少于野生型。流式细胞检测结果确认mdn1-1根中有较多的细胞处于G0/G1阶段，说明MDN1的功能紊乱影响了根部细胞周期，进而减缓了细胞分裂。通过检测核糖体蛋白的亚细胞分布，发现mdn1-1影响了60S核糖体大亚基出核过程。此外，核糖体RNA（rRNA）加工也明显受影响，包括35S、27SB以及20S等rRNA前体均在mdn1-1中具有较高水平的积累。更重要的是，MDN1可以与另一个核糖体组装因子PESCADILLO 2 （PES2）发生互作，且PES2的亚细胞定位在mdn1-1中出现异常。这些结果暗示MDN1在核糖体生物合成过程中起着不可或缺的作用。进一步表型分析发现，mdn1-1对真核细胞翻译抑制剂及高糖环境敏感，与其他核糖体缺陷突变体表型类似。总之，这项研究确立了拟南芥MDN1在核糖体生物合成中的作用，初步解释了mdn1-1发育缺陷的原因。