常温机械灌注系统中HO-1基因修饰的BMMSCs修复DCD供肝的作用及其分子机制研究

Abstract: Donation after cardiac death has become an important way to meet the severe shortage of donor graft in China. Warm ischemia injury to DCD liver graft is inevitable in the process of cardiac arrest. In addition, the lack of accurate assessment tool and effective repair measurement for DCD liver graft leads to high incidence of complications after transplantation, and reduces the utilization of this kind of liver graft. Normothermic machine perfusion could replenish the liver graft with oxygen and nutrients, reduce ATP loss and promote production of protective proteins. But it was unable to repair damaged hepatic sinusoidal endothelial cells and control the activation of immune cell. Our preliminary studies showed that bone marrow mesenchymal stem cells (BM MSCs) transplantation could reduce the ischemia-reperfusion injury and promote the repair of hepatocytes, and BM MSCs modified by HO-1 showed improved activity and effects. So we assume to introduce HO-1 gene modified BM MSCs to our preliminary designed normothermic machine perfusion system, which will provide a living environment for BM MSCs, avoid loss of BM MSCs during homing process, and repair the DCD liver graft in vitro. Through the observation we could explore its repair mechanism and establish the criteria for DCD liver utilization, which may provide an important new method to improve the quality of DCD liver graft.

心脏死亡捐献（DCD）供体已成为解决我国器官严重短缺的主要途径，但DCD供肝在心脏停跳过程中不可避免经历热缺血损伤，而且目前缺乏精确的评估以及有效的修复方法，导致肝移植术后并发症发生率高，从而降低DCD供肝的利用率。常温机械灌注能够补充氧和营养物质、减少ATP丢失及促进保护性蛋白的产生，但是其不能完全修复已受损的肝窦内皮及控制免疫细胞活化。我们前期研究发现：1.骨髓间充质干细胞（BM MSCs）移植能够减轻大鼠移植肝缺血-再灌注损伤，并促进肝细胞的修复；2.血红素加氧酶-1（HO-1）修饰BM MSCs可以提高BM MSCs的活性和增强其作用。故我们设想建立常温机械灌注系统，为HO-1修饰的BM MSCs提供生存环境，同时避免归巢过程中BM MSCs的丢失，最终实现体外对DCD供肝的修复。在此过程中研究其机制并建立DCD供肝的使用标准，从而为研究如何提高DCD供肝质量提供新的重要方法。

肝移植已经成为终末期肝病最有效的治疗措施，随着等待肝移植患者数量的不断增加，供肝短缺问题日趋严重。目前，心脏死亡器官捐献（DCD）已经成为我国移植器官的重要来源。DCD移植肝不可避免要经历热缺血再灌注（I/R）损伤，影响受者长期存活。为此，本研究针对“热I/R损伤”的特点，采用常温机械灌注（NMP）联合血红素加氧酶-1（HO-1）修饰的骨髓间充质干细胞（BMMSCs），即（HO-1/BMMSCs）修复DCD供肝，探讨其对减轻移植肝I/R损伤、改善肝窦微循环和肝脏能量代谢、控制Kupffer细胞和内皮细胞的活化强度等的影响，并揭示其分子机制。同时建立优化灌注液的成分并建立大鼠DCD供肝的使用标准。本课题主要研究成果如下：.（1）建立了NMP体系、优化了灌注液的成分和输注条件，培养了高质、高产的BMMSCs，同时将HO-1转染至BMMSCs，形成稳定、安全的HO-l/BMMSCs；.（2）发现了微循环和能量代谢参与了NMP联合HO-1/BMMSCs对DCD供肝的保护作用；并通过I/R损伤及移植排斥反应两种大鼠肝移植模型进行研究，探索了该体系对不同热缺血时间DCD大鼠肝脏热I/R损伤及移植排斥反应的修复作用；.（3）揭示了在大鼠肝脏热I/R损伤原位肝移植模型中，NMP联合HO-l/BMMSCs不仅能够延长肝移植受体的存活时间，而且能促进DCD移植肝的再生与修复，对移植后受体具有明显的保护作用，其机制与高迁移率蛋白B1表达量变化及抑制TLR4/NF-кb介导的炎症反应通路相关；.（4）在大鼠肝移植排斥模型中， 证明了NMP联合HO-1/BMMSCs能减轻DCD供肝移植术后移植肝的排斥反应程度，其对DCD移植肝有免疫保护作用。揭示了其机制与细胞因子、DC细胞增殖和NKT细胞活性等相关。.本研究揭示了NMP联合HO-1/BMMSCs修复DCD移植肝的作用，明确了该方法保护DCD供肝的肝窦微循环和肝脏能量代谢变化的规律，揭示了其修复DCD移植肝I/R损伤和减轻移植排斥反应的作用及机制，为如何高质量使用DCD供肝开启了新的途径。截至该项目结题，已在《Cell Death Dis》等期刊发表SCI收录论文10篇，中文核心期刊论文7篇，参加国家级会议5次，培养博士、硕士研究生10名，申报专利2项，获批1项。