肉豆蔻木酚素通过PI3K介导mTOR和FoxO3a信号通路调控AD大鼠认知功能的机制研究

Microglia activation produced inflammatory mediators to damage neurons in AD, and as a result, cognitive function is badly affected. Therefore, the key of study is to regulate microglial function and make its development direction turn to protect the neurons. Our previous study showed that the transition Nutmeg guaiacol prime (Macelignan) could inhibit the excessive activation of microglia and the abnormal expressions of pERK and mTOR, and improved the cognitive function in AD model rats. The results indicated that macelignan played anti-inflammatory and neuroprotective roles in AD rats. In recent years, the role of microglia regulation neurons function has been gradually concern, however, the mechanism of PI3K/mTOR and FoxO3a signaling pathways regulation microglia polarized phenotype to improve the cognitive function and intervention role of macelignan in AD rats has not been reported. In this study, we will investigate PI3K/mTOR and FoxO3a initiate some signaling cascades to regulate cognitive function, and explore the effects of macelignan on the brain injury in AD rats. Finally, we will determine signal transduction in microglia and neurons and the regulation mechanism of cognitive function in AD rats, and clarify the target of macelignan. Our results will provide scientific basis for natural drug development and AD prevention and treatment.

阿尔茨海默病患者脑内有大量被激活的小胶质细胞，产生大量炎症介质，毒害神经元，影响认知功能。因此，调控小胶质细胞的活性，使其向保护神经元的方向发展是研究之关键。前期研究发现，肉豆蔻木酚素（Macelignan）可抑制小胶质细胞的过度激活及pERK和mTOR的异常表达，显著改善AD模型大鼠认知功能障碍，显示其良好的抗炎和神经保护作用。近年来，小胶质细胞对神经元的调节作用渐被关注，但PI3K介导mTOR和FoxO3a信号通路调控小胶质细胞极化表型，改善AD认知功能的机制及肉豆蔻木酚素的干预作用尚未见报道。因此，本研究拟利用神经炎症和慢性血管性痴呆模型大鼠，研究在AD中PI3K介导mTOR和FoxO3a信号通路对认知功能的作用，探讨肉豆蔻木酚素对AD脑损伤的影响，明确小胶质细胞对神经元及AD大鼠认知功能的调控机制，阐明肉豆蔻木酚素的作用靶点，研究成果将为抗AD天然药物的开发及其防治提供科学依据。

为阐明肉豆蔻木酚素通过PI3K介导的mTOR和FoxO3a信号通路改善AD大鼠认知功能的调控机制，项目组圆满完成了4项计划研究内容和拓展研究。(1)建立神经炎症细胞模型，给予Macelignan干预，①运用MTT法，检测肉豆蔻木酚素对小胶质细胞和神经元活力的影响；②运用Griess法，检测被激活的小胶质细胞培养基上清中NO变化的影响；③运用荧光染色技术，观察小胶质细胞iNOS和FoxO3a表达情况以及海马神经元CyclinD1及p27表达情况；④运用免疫蛋白印迹法，检测被激活的小胶质细胞p-PI3K、p-Akt、p-FOXO3a、p-mTOR等蛋白表达情况；⑤制备脂多糖激活的小胶质细胞条件培养基，检测Macelignan对鼠性海马神经元生存率、形态学和细胞周期相关蛋白表达的影响，确认肉豆蔻木酚素通过PI3K/mTOR和FoxO3a等信号通路对神经炎症的调控机制。(2)运用谷氨酸诱导海马神经元损伤细胞模型，通过不同浓度的肉豆蔻木酚素干预处理，①运用MTT法，检测不同浓度肉豆蔻木酚素和谷氨酸对神经元活性的影响；②运用 HE染色法，谷氨酸和肉豆蔻木酚素对细胞形态变化；③运用免疫组化技术，检测谷氨酸和肉豆蔻木酚素对cyclinD1及p21的表达情况的影响；④运用免疫蛋白印迹法，检测cyclinD1表达情况；⑤Tunel法检测细胞凋亡情况；⑥运用免疫荧光染色法，检测相关细胞周期蛋白的表达，确认Macelignan对神经元损伤的调控作用及其机制。(3)建立慢性缺血缺氧性动物模型，给予肉豆蔻提取物干预, 运用HE染色、ELISA技术、免疫组织化学方法和分子生物学技术，检测大鼠神经行为学变化、脉络丛和脑组织结构变化、脑组织NGF水平及mTOR等蛋白表达的影响，阐明和确认了肉豆蔻提取物对缺血缺氧大鼠空间学习和记忆功能损害的改善作用。实验研究进一步拓展，确认了肉豆蔻提取物对慢性缺血缺氧大鼠脑组织Klotho蛋白活性及表达的调控，进一步阐明肉豆蔻提取物可通过增强大鼠脑组织中Klotho蛋白活性，抑制神经炎症反应。(4)研究内容进一步拓展, 发现Gli1和LETM1是预测肺癌、食管癌及乳腺癌进展及预后的重要指标，为神经炎症介导的Gli1、LETM1对胶质瘤干细胞特性的调控机制研究及胶质瘤的靶向治疗提供新的思路和策略。