Xist基因干扰对猪核移植克隆胚胎发育的调控机理研究

哺乳动物体细胞核移植(SCNT)克隆胚胎发育停滞和死亡的比例极高，被认为与基因组遗传修饰异常有关，最新研究显示Xist基因在啮齿类SCNT胚胎发育中扮演重要角色。本研究利用慢病毒介导的长效RNA干扰技术沉默核供体细胞中的Xist基因，并以此制备克隆胚胎，阐明Xist基因沉默对猪SCNT克隆胚胎发育的影响，进一步通过分析核移植克隆胚胎发育中Xist、Tsix、G6PD、Foxp3、MAOA等X染色体连锁基因的转录水平，组蛋白H3K4、H3K9、H3K27的甲基化特征，以及克隆后代细胞中Xist基因的DNA甲基化修饰水平，探讨Xist基因干扰对猪核移植克隆胚胎发育的调控机理。本项研究的实施不仅可以解决目前猪SCNT克隆成功率低的科学问题，而且可以为今后深入开展猪胚胎工程与新型猪育种中的核移植克隆研究提供关键技术参数和理论依据。

哺乳动物体细胞核移植(SCNT)克隆胚胎的发育能力在胚胎工程研究中具有重要的意义，最新研究显示Xist基因在小鼠SCNT胚胎发育中扮演重要角色。对Xist基因的研究不仅可以改善猪SCNT胚胎的发育力，而且可以为改进哺乳动物核移植的成功率提供参考。本项目的主要研究内容围绕猪Xist基因克隆与shRNA真核干扰载体筛选以及Xist基因干扰对核移植克隆胚胎发育的影响展开。课题取得的主要结果包括：① PCR技术克隆获得了长约21083bp的猪Xist基因，共7个外显子，长度分别为13810bp、89bp、136bp、209bp、329bp、129bp、6381bp；② 以Xist基因外显子序列为目标筛选出4个能有效干扰Xist基因表达的真核干扰载体pENTR4-H1-Xist-shRNA2,4,5,6，其中pENTR4-H1-Xist-shRNA5在转细胞72h后有最佳干扰效果，最长可以维持5天以上的干扰作用；③ pENTR4-H1-Xist-shRNA5与体细胞共同制备猪克隆胚胎，随着胚胎内Xist基因的表达被下调，X染色体连锁基因G6PD、Foxp3、MAOA的表达丰度也呈现显著下降，但是Tsix基因的转录水平则不受影响；④ Xist基因被干扰后，猪克隆胚胎的卵裂率和囊胚发育率有显著提高；⑤ 本项目发表中文核心论文1篇，学会论文摘要1篇，投稿SCI论文1篇，授权国家发明专利1项，2013年和2015年毕业硕士各1名（杜江涛、曹卫东）。