蛋白磷酸酶2A催化亚基OSPP13调控水稻雄性不育的机理研究

Pollen sterility is crucial for rice yield and male-sterile mutants are ideal materials for studying the molecular mechanism of pollen development in rice. In previous research, we found a rice mutant ospp13(protein phosphatase 13) which exhibited complete male sterility. Through fine mapping, OSPP13 was restricted to a 52-kb region on rice chromosome 1. By sequencing the entire region, a single nucleotide conversion was found in the coding region of ORF6, which caused early termination. By using complementary test, we confirmed that ORF6 corresponds to the OSPP13 gene and encodes a protein phosphatase 2A. Phylogenetic analysis showed that OSPP13 protein belonged to the catalytic subunit C group of PP2A protein. In order to reveal the genetic mechanism and molecular regulation role of OSPP13 protein in male sterility, we will observe the chromosome behavior and spindle formation in male meiosis, analyze the spatial and temporal expression pattern of OSPP13, investigate the subcellular localization of OSPP13 protein, point out the function of OSPP13 in regulating pollen development network, and verify direct interactive proteins.

水稻雄性不育是影响水稻产量的关键因子之一。雄性不育突变体是研究水稻花粉发育机制的理想材料。本项目前期发现一个水稻雄性不育突变体ospp13(protein phosphatase 13)，并将该OSPP13基因精细定位在水稻第1染色体上约52-kb的区间内。对该区域测序发现该突变体在第6个开放阅读框（ORF）的编码区存在一个单碱基突变，导致蛋白翻译的提前终止。通过功能互补验证，证实ORF6是OSPP13的目的基因，该基因编码一个水稻蛋白磷酸酶2A(PP2A)。系统进化分析表明OSPP13蛋白属于PP2A蛋白的催化亚基C分支。本研究将通过进一步观察该突变体小孢子减数分裂过程中染色体行为和纺锤体的形成、分析OSPP13的时空表达模式、研究亚细胞定位特性、确定OSPP13基因在花粉发育调控网络中的位置,筛选并验证其互作蛋白，揭示OSPP13蛋白调控水稻雄性不育的机制。

水稻是我国主要的粮食作物之一，是我国近60%人口的主粮。水稻雄性不育直接影响小穗育性，可导致减产甚至绝产。在水稻中发掘、克隆和利用新的雄性不育基因，阐明其调控花粉发育的途径，有助于揭示雄性不育的遗传机制，对水稻育种和生产具有重要的科学指导意义。本项目通过EMS诱变粳稻品种日本晴，经过多代连续自交，获得性状稳定的花粉不育突变体材料ospp13（protein phosphatase 13）。该突变体花粉完全败育，小穗不结实。进一步观察发现，突变体ospp13花粉粒无淀粉积累，胚囊育性正常。遗传分析表明，该突变性状受隐性核基因控制。通过图位克隆的方法，将该基因定位在52-Kb区间。进一步测序分析，发现突变体在定位区间内有一个编码蛋白磷酸酶基因的编码区发生了一个碱基的改变、导致蛋白翻译的提前终止,并将该基因作为候选基因，命名为OSPP13。利用OSPP13基因的蛋白序列进行聚类分析，最终将OSPP13蛋白聚类到PP2A蛋白催化亚基分支。通过互补实验和CRISPR/CAS9基因敲除技术,对该候选基因进行功能验证，证实该基因确实是一个调控雄性不育的新基因。时空表达模式分析发现OSPP13基因在花粉减数分裂期表达量最高。OSPP13蛋白定位在水稻原生质体的内质网。通过测定野生型和突变体ospp13中的PP2A蛋白酶磷酸酶活性，发现无论是在野生型和突变体中，OsPP13蛋白都不具有PP2A蛋白磷酸酶活性。对OSPP13基因与小孢子发育途径中各基因的上下游关系进行研究，发现DWP基因和CYP704B2基因可能位于OSPP13基因的下游，共同调控小孢子的发育。本研究通过探讨OSPP13蛋白的细胞学特征、生理特性、遗传特性，从细胞学、转录水平和蛋白水平揭示OSPP13蛋白调控水稻雄性不育的机制。