马蔺半胱氨酸富集蛋白IlCDT1调控耐镉性的分子作用机制

Iris lactea Pall.var.chinensis is a perennial herb of our country and it has the features of fast growth, large biomass, wide adaptability, strong resistance and beautiful ornamental with well prospect in the construction of ecological construction. Our previous studies showed that Iris lactea var.chinensis has the strong ability of Cd uptake and accumulation with high transfer coefficient. On the basis of transcriptome sequencing, a highly cysteine-rich protein named IlCDT1 was screened. It can confer cadmium tolerance on yeast cells and plants. In present proposal, we plan to screen the binding transcription factor of IlCDT1 promoter cis-element using the yeast one hybrid, then using ChIP-qPCR and EMSA to confirm the interaction. We aim to use yeast two-hybrid to screen IlCDT1's interaction proteins and confirm key domain and amino acid sites of IlCDT1, then using BiFC, and GST Pull-down and CoIP to confirm the interaction. We will investigate the function of screened candidate genes using gene expression and over-expression transgenic system in both Arabidopsis and Iris. Taken together, the present proposal will disclose up-regulation and post-translational regulation mechanism of IlCDT1, enrich the understanding of how cysteine-rich proteins play roles in plant Cd tolerance, which will provide the candidate genes for improvement of Iris Cd tolerance. Therefore, the present proposal is of both theoretical and practical significance.

马蔺原产中国，是鸢尾科鸢尾属多年生草本植物，具有生长速度快、生物量大、适应性广、抗性强、观赏性好等特性，在生态建设中有良好的应用前景。本项目组前期的研究表明，马蔺对Cd吸收和富集能力强，转运系数高。在转录组测序的基础上，我们挖掘到半胱氨酸富集蛋白IlCDT1。前期研究表明，IlCDT1具Cd抗性。本研究拟通过酵母单杂交筛选IlCDT1上游调控转录因子，并运用ChIP-qPCR、EMSA等实验验证。通过酵母双杂交从马蔺文库中筛选IlCDT1的互作蛋白，并确认IlCDT1蛋白关键结构域和氨基酸位点，继而运用BiFC、GST Pull-down和CoIP进行验证。通过基因表达特性分析和转基因手段对筛选出的候选基因进行功能鉴定，最终解释马蔺IlCDT1上游调控和翻译后调控机制。该研究不仅能丰富植物半胱氨酸富集蛋白调控耐Cd性的基础，也可为鸢尾Cd抗性分子育种奠定基础，具有重要的科学意义和应用前景。

马蔺原产中国，是鸢尾科鸢尾属多年生宿根草本植物，具有生长速度快、生物量大、适应性广、抗性强、观赏性好等特性，在生态建设中有良好的应用前景。镉（Cd）是毒性最强的重金属之一，通过食物链在人体内富集，对人体健康造成严重影响。本项目构建了酵母文库，通过酵母双杂交筛选IlMT2a互作蛋白，二轮筛选后，共获得59个阳性克隆，一对一验证后共筛选出27个与IlMT2a存在互作的基因，综合评估后，选择IlMT3（同为金属硫蛋白基因）和IlAP2（转录因子）进行功能验证。IlMT3共编码62个氨基酸，I1AP2共编码432个氨基酸。转基因实验表明，IlMT3转基因植株和对照在CdCl2胁迫下，没有显著差异，但IlMT2a和IlMT3互作机制对马蔺Cd胁迫的影响仍需继续研究。IlAP2是一个细胞核定位的转录因子。半定量和荧光定量实验表明，IlAP2在胁迫处理后表达量呈现上调的趋势。I1AP2过表达拟南芥相比于野生型拟南芥对Cd胁迫具有更高的耐受性，生物信息学分析表明，IlAP2能够影响拟南芥响应Cd胁迫，从而形成一个复杂的植物抗逆调控网络。通过染色体步移获得IlCDT1翻译起始位点上游共1934 bp的启动子序列。通过酶切法将启动子分段插入LUC表达载体中，分析推测P2-P3启动子间247bp片段是Cd诱导的核心启动子区域，命名为IlCDT1 pro。通过酵母单杂交，筛选出28个阳性克隆能够与pHis-pro互作。将28个阳性克隆序列与本地马蔺全长序列进行blast比对，最终获得12个序列全长，利用Uniprot数据库对12个基因进行功能注释，共有9个基因具有注释信息，其中unigene23642被注释为NF-YC6型转录因子。IlNF-YC2是一个细胞核定位的转录因子，半定量和定量结果显示IlNF-YC2在胁迫处理后表达量呈现上调的趋势。转基因实验表明，IlNF-YC2过表达拟南芥相比于野生型拟南芥对Cd胁迫具有更高的耐受性。在基金的资助下，本项目还开展了马蔺全长转录组测序和马蔺干旱和盐胁迫转录组分析。本申请项目的实施可丰富马蔺Cd耐性分子机理，为分子育种奠定基础。