基于Ecotilling技术的象草木质素合成基因优异等位基因发掘

Elephant grass (Pennisetum purpureum Schum.) is an excellent forage crop, and a promising lignocellulosic energy crop. Lignin is the critical factor for cell wall degradability which affect not only feed quality but also cell wall sugar conversion efficiency. To date, the genetics and molecular biology research on lignin synthesis of elephant grass is very insufficient. In this study, we develop Ecotilling technique to detect allelic variation in elephant grass and clone five genes (4CL, F5H, COMT, CCR and CAD) involved in lignin synthesis of elephant grass. The cDNA encoding full-length of COMT and F5H genes will be cloned from cDNA prepared from leaf tissue using RT-PCR and RACE methods and the DNA sequence informations of 4CL, CCR and CAD will be obtaineded from NCBI. And a set of 130 elephant grass lines are chosen for allelic varieties genotyping and cell wall degradability phenotyping. Furthmore, based on the population structure analysis, association analysis is conducted to identify the functional allelic variations and functional haplotypes related to cell wall degradability within each of the five genes by logistic model. The results obtained in this study will help us to understand the genetic and molecular mechanism of lignin synthesis and provide theoretical guidance for breeding program in elephant grass.

象草是优质饲料作物，也是极具潜力的木质纤维素类能源植物。象草细胞壁可降解性影响其饲用品质和生物质能的糖转化效率。研究表明木质素是限制细胞壁降解的关键因素。国内外象草木质素合成的分子生物学研究报道不多，亟待加强。本项目拟在象草中建立高通量检测等位基因变异的Ecotilling技术平台，以具有广泛遗传差异的130份象草为材料，利用同源基因克隆技术和已知基因信息克隆象草木质素合成途径的5个关键基因（4CL、COMT、F5H、CAD和CCR），利用Ecotilling技术分析象草群体中这5个基因的等位基因变异，并通过细胞壁可降解性评价指标的多次测定和评估，结合群体遗传结构分析和这5个基因等位基因多态性分析、LD分析和单倍型分析开展基于候选基因策略的关联分析。旨在发掘象草中与细胞壁可降解性相关的关键基因及其优异等位基因变异和功能单倍型，为象草品种改良提供参考依据，具有重要的理论意义和实践价值。

象草是优质饲料作物，也是极具潜力的木质纤维素类能源植物。象草细胞壁可降解性不仅影响其饲用品质，而且影响其生物质能的糖转化效率。研究表明木质素是限制细胞壁降解的关键因素。国内外象草木质素合成的遗传学、分子生物学相关研究报道不多，亟待加强。. 本项目以遗传差异显著的的象草资源为材料，比较了不同象草的农艺性状、细胞壁可降解性和细胞壁机械性能。对茎杆木质素含量差异显著的两份象草材料茎转录组进行比较测序分析，筛选组装后获得87,641个 unigene，其中62557个unigene与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性。这些unigene根据GO功能大致可分为细胞组分、分子功能和生物学过程三大类55个分支，其中有大量unigene与代谢进程、结合活性和细胞进程相关。将unigene与COG数据库进行比对，根据其功能大致可分为25类。KEGG数据库作为参考，依据代谢途径可将unigene定位到308个代谢途径分支。两个表达谱之间共发现了33323个差异表达基因，其中eg7相对eg87有9704个上调基因和23619个下调基因。利用转录组序列信息，成功克隆了4CL、CAD、CCR、CCoAOMT1、CCoAOMT2和F5H基因，对获得的基因进行序列同源性搜索、结构域搜索及3D结构预测、分子系统进化树构建等生物信息学分析；基因表达分析结果表明不同生长阶段的根、茎、叶中这6个基因表达模式不同。基因序列和表达分析表明， 4CL、CAD、CCR、CCoAOMT2全长cDNA序列在eg7和eg87中无差异，CpCCoAOMT1 OR区具有SNP和插入/缺失突变。高木质素含量的eg7茎中这些基因的表达显著高于低木质素含量的eg87。进一步在42个象草材料中克隆CpCCoAOMT1 ORF区，结果显示，ORF区全长802bp，发现7个SNP(11A＞C; 26A＞G; 32G＞C; 33A＞C；35A＞C；37C＞G；358G＞C)和2个Indel；共有7种单倍型。关联分析发现，37C＞G位点与木质素含量相关，与鲜草产量显著相关，C型ADL平均为10.0%，鲜草平均产量153.3吨/公顷，G型ADL平均为12.6%，鲜草平均产量121.6吨/公顷。. 项目研究结果为象草品种改良提供参考依据，具有重要的理论意义和实践价值。