新结构BRD4抑制剂通过诱导ATG5依赖的自噬性细胞死亡对去势抵抗前列腺癌的治疗作用和分子机制

Epigenetic regulation involves in the occurrence and development of castration resistant prostate cancer (CRPC). Bromodomain protein 4 (BRD4) is one of the members of BET protein family playing key roles in epigenetic regulation. The basic research in recent 2 years revealed that BRD4 expression was up-regulated in a variety of prostate cancer cells and prostate cancer tissues; the prostate cancer cells occuring resistant to androgen deprivation therapy, could be sensitive to BRD4-targeted agents. We designed and synthetized a new skeleton structure BRD4 small molecule inhibitor named BI06, and firstly found that it had the effect inducing autophagic cell death of prostate cancer cells, which is dependent ATG5 instead of Beclin1/Vps34 complex and may interact with androgen receptor signal pathway to regulate cell proliferation, metastasis and programmed cell death of prostate cancer. Based on these new findings, we will further study BRD4 expression and its clinical pathological significances in prostate cancer, especially in CRPC; elucidate the interactions of BRD4 and AR signal pathway in the regulation of autophagic cell death in CRPC; and construct the important protein signal network involving BRD4 and AR signal pathway of autophagy. This would be important to develop novel biomarkers, therapeutic strategy and targeted drugs inducing autophagic cell death for the treatment of CRPC.

表观遗传调控参与去势抵抗性前列腺癌（CRPC）发生发展各阶段。溴结构域蛋白BRD4是在表观遗传调控中起关键作用的BET蛋白家族成员之一。近2年的研究发现：BRD4在多种前列腺癌细胞和前列腺癌组织中表达上调；当前列腺癌细胞对雄激素剥夺治疗耐药时，仍可能对靶向BRD4的药物敏感。本课题组前期设计并合成了一种新骨架结构的BRD4小分子抑制剂BI06，首次发现其诱导前列腺癌细胞自噬性死亡，该作用依赖于自噬相关蛋白ATG5而与通常的自噬复合体Beclin1/Vps34无关，且可能与雄激素受体信号通路相互作用而进一步调控细胞增殖和凋亡。本项目拟在此基础上，进一步研究BRD4和AR信号通路的相互作用及其诱导CRPC细胞自噬性死亡的机制，并构建以BRD4和AR信号通路中重要蛋白为节点的CRPC信号调控网络。更深入地了解CRPC分子发病机制，并为发现新的靶向治疗策略和生物标志物提供理论和实验依据。

蛋白的多种翻译后修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化使机体呈现出表观遗传学的多态性，其中通过组蛋白乙酰化作用的表观遗传调控调节着 细胞进程，包括细胞凋亡，细胞周期，细胞生长和分化。组蛋白乙酰化调控过 程中组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases, HDACs)和溴结构域蛋白 4(BRD4) 分别起着去乙酰化和识别乙酰化的作用。癌细胞中，HDACs 和 BRD4 过度表达 使抑癌基因转录受抑制，原癌基因表达激活，促使癌症的发生和发展。以 HDACs 和 BRD4 为靶点的抗肿瘤药物研究中，多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs） 和 BRD4 抑制剂被合成报道，且有 5 种 HDACIs 已经被 FDA 批准用于临床抗肿 瘤治疗。另一方面，近年结直肠癌（Colorectal carcinoma, CRC）的发病率和死亡率每年均呈明显上升趋势，严重威胁着人们的健康安全。结直肠癌细胞中， HDACs 和 BRD4 均出现过度表达的现象。因此，我们选择结直肠癌为研究对象， 拟设计、合成一种新型的 BRD4/HDAC 双靶点小分子抑制剂，并经过体内、外 抗癌活性的测试实验，分子机制研究等实验，筛选出抗结直肠癌活性优良的先 导化合物。首先我们以基于片段的药物发现为原理，设计出噻吩并[2,3-d]嘧啶 的 BRD4 抑制剂骨架结构。通过Gewald 反应、嘧啶环关环反应合成 BRD4 抑制 剂骨架，并对合成的 BRD4 抑制剂骨架进行体外酶活性测试和人结肠癌细胞 HCT-116 的抗癌活性评价，选出活性最优的化合物 17c 作为 BRD4/HDAC 双靶点 抑制剂的 BRD4 骨架结构，在 17c 的结构基础上引入 HDACIs 的连接区和锌离子 结合区，设计出 BRD4/HDAC 双靶点抑制剂的结构。按照逆向合成法设计目标 化合物的合成路线，并经有机合成得到目标产物，同时对结构进行表征确认。随后通过酶活性测试和MTT 比色法测试目标化合物体外抗结直肠癌活性，Annexin V/PI 双染色的流式细胞术分析以及Hoechst 33258 染色检测对结直肠癌细胞的诱导凋亡作用，Western blot 实验探讨抗肿瘤作用机制，小鼠结直肠癌移植瘤模型中评价化合物体内抗肿瘤活性和安全性。