含HSV-2 gD基因重组腺病毒修饰的抗II型单纯疱疹病毒树突状细胞疫苗的构建及其免疫效应研究

生殖器疱疹预防困难，传染性强，复发率高，严重影响患者生活质量。现有的治疗手段与疾病高复发率相比显得有些苍白无力，因而迫切需要发展某种有效、安全的疫苗用来防治生殖器疱疹。我们已经构建了HSV-2-gD蛋白疫苗、核酸疫苗并进行了初步的动物实验，结果显示我们构建的疫苗诱发的细胞免疫尚不理想。由于细胞免疫在机体抗病毒治疗中起主要作用，一种安全、高效，特别是可以诱发出较高细胞免疫能力的疫苗的研究迫在眉睫。本项目以单纯疱疹病毒组装必需的gD基因为靶点，应用安全、高效、简便的Adeno-X载体系统构建含HSV-2 gD基因的重组腺病毒，包装后转染从小鼠骨髓分离的树突状细胞，在细胞水平证实其表达后进一步探讨该疫苗在动物水平诱发的体液免疫和细胞免疫，充分发挥了腺病毒载体系统和树突状细胞疫苗的优点，为单纯疱疹病毒疫苗的研究提供新的思路和手段，并为其下一步研究及临床应用提供实验依据。

生殖器疱疹(GH)主要由单纯疱疹2型(HSV-2)感染所致,该病毒具嗜神经性,原发感染机体后易在骶尾神经节内建立终生潜伏,极难彻底清除,并可因多种非特异因素刺激而导致复发。GH发病率逐年上升,目前尚无彻底治愈的方法。近年来，疫苗由于能诱导出较好的细胞免疫和体液免疫而日益受到重视。研制有效的生殖器疱疹病毒疫苗，是预防和治疗单纯疱疹病毒II型（HSV-2）感染的关键。本研究将HSV-2gD蛋白基因克隆到质粒载体Shuttle-2，重组质粒酶切鉴定、测序鉴定后构建重组腺病毒pAdeno-HSV-2 gD。pAdeno-HSV-2 gD转染DC细胞后，用免疫组织化学、RT-PCR、SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定HSV-2 gD的表达情况。然后用我们制备的腺病毒介导的HSV-2 gD基因修饰的树突状细胞（pAdeno-HSV-2 gD-DC）疫苗免疫BALB/c小鼠3次，末次免疫后第10天检测小鼠血清中gD IgG水平，同时，分离小鼠脾淋巴细胞并用单纯疱疹病毒-2gD蛋白刺激，用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况、乳酸脱氢酶释放法测定CTL活性及ELASA法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-4水平，最后用病毒攻击实验检测疫苗对HSV-2病毒感染的保护作用。结果显示：我们克隆的gD序列正确, 表达产物的SDS-PAGE分析发现，在相对分子量为43KD处有外源蛋白表达，与预期蛋白带一致。RT-PCR、免疫组织化学方法和Western blotting也证明，HSV-2 gD能在DC细胞内表达。动物实验显示：pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗可以诱导小鼠产生针对单纯疱疹病毒-2gD蛋白的抗体、诱导脾淋巴细胞增殖、有效杀伤靶细胞及分泌IFN-γ、IL-4，与pAdeno-DC组、DC组、空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)。病毒攻击实验表明pAdeno-HSV-2 gD-DC能有效减轻免疫小鼠接受致死量病毒的攻击，具有明显的保护作用。这些结果表明我们构建的pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗可以在小鼠中产生较强的细胞免疫和体液免疫，为生殖器疱疹疫苗下一步研究提供了坚实基础。