枸杞多糖对小胶质细胞在视神经轴突继发性溃变中作用的调节

Our previous study has shown that microglia were activated in areas vulnerable to secondary degeneration after partial optic nerve transection (PONT) and the polysaccharides extracted from Lycium Barbarum (LBP) could reduce secondary degeneration of axons and the number of activated microglia in secondary degeneration of optic nerves (ONs). The aims of this project is to study the roles of microglia in secondary degeneration of ONs after PONT, the effects of LBP on microglia and the related mechanisms. (1) In vivo study: Various methods including the transmission electron microscopy, immunohistochemical staining and Western blot analysis will be used to detect the activation of microglia in oxidative stress caused by PONT；the levels of proteins related with microglia activation and the relationship between microglia and autophagy after PONT. Then the roles of LBP these reactions will be examined. (2) In vitro study: BV2 microglia cell line will be used in this study. Oxidative stress will be induced by H2O2 in BV2 cell line and the proteins related with microglia activation and autophagy will be detected by immunocytochemistry and Western blot. In addition, different drugs will be used to induce or inhibit autophagy in microglia in oxidative stress. Then the effects of LBP on these reactions will be detected in vivo.

申请人以往的研究表明在视神经部分切断后的轴突继发性损伤部位有小胶质细胞的激活，而枸杞多糖可以减少轴突的继发性溃变和小胶质细胞的激活。因此本课题将采取体内和体外两部分实验来研究小胶质细胞在视神经轴突继发性溃变中的作用以及枸杞多糖的调节机制。（1）在体内实验部分，会利用视神经部分切断的模型，通过透射电镜、免疫组织化学和蛋白免疫沉淀等方法研究小胶质细胞活化相关蛋白的表达；小胶质细胞在氧化应激中的作用以及小胶质细胞和自噬激活的相关性。然后会研究枸杞多糖对这些体内反应的效应。（2）在体外实验部分，会研究培养的小胶质细胞在氧化应激环境下的活化状态以及活性蛋白的表达；氧化应激对小胶质细胞自噬激活的影响。此外，体外实验还会观察在氧化应激条件下采用不同的药物分别诱导和抑制自噬后对小胶质细胞活性的调节。然后研究枸杞多糖对这些体外反应的调节作用。

视网膜神经节细胞在青光眼中会发生继发性的损伤，视神经部分切断模型可将视网膜神经节细胞的原发性损伤和继发性损伤区别开来，因此相比其他模型，更适合用于研究视网膜神经节细胞的继发性损伤机制和保护作用机制。以往的研究证明小胶质细胞/巨噬细胞和自噬都在视网膜神经节细胞的死亡/保护中发挥作用。以往我们的研究也证实枸杞多糖对小胶质细胞/巨噬细胞的激活有调节作用。因此，本项目主要进行了两方面的研究：1.小胶质细胞/巨噬细胞的激活以及自噬在视网膜神经节细胞死亡中的作用。2.枸杞多糖对大鼠视神经部分切断后视网膜神经节细胞的保护作用与小胶质/巨噬细胞和自噬之间的具体的关联。我们的研究结果发现：1.用小鼠的视神经挤压模型，发现自噬对视网膜神经节细胞起着保护作用，自噬抑制剂可以增加视网膜神经节细胞的死亡；而自噬激活剂可以减少视网膜神经节细胞的死亡。2.用小鼠的视神经挤压模型发现，除了损伤同侧有节细胞的死亡和小胶质/巨噬细胞的激活，损伤对侧眼也有节细胞的死亡和小胶质/巨噬细胞的激活；小胶质细胞/巨噬细胞抑制剂可以减少对侧视网膜节细胞的死亡。3.我们采用了一种新的手术入路，从视神经的颞侧部分切断视神经，相比以往从上方切断视神经更简单易行。4.枸杞多糖可减少视网膜神经节细胞的继发性损伤，促进小胶质/巨噬细胞向具有保护作用的M2的方向极化，自噬的水平在用了枸杞多糖后会降低。